萬(wàn)志敏， 許沛虎， 張雪瓊， 靳文運(yùn)， 朱中佳

（武漢理工大學(xué)化工學(xué)院，湖北武漢 430070）

草木犀為豆科（Legum ino sae）草木犀屬（Melilotus Mill.）一年或兩年生草本植物，該屬植物全世界約有20種，其中黃花草木犀主要分布于溫帶、亞熱帶、歐亞大陸及地中海地區(qū)，是家畜重要的優(yōu)質(zhì)牧草之一，同時(shí)民間以葉、花制成軟膏，用作外傷藥;或煎服用于治療浮腫、腹痛、瘧疾等癥。具有止咳平喘、清熱解毒、解痙止痛、化濕和中的功效。我國(guó)《部頒標(biāo)準(zhǔn)》、《藏藥標(biāo)準(zhǔn)》和《上海市藥材標(biāo)準(zhǔn)》有所收載。本實(shí)驗(yàn)主要以總香豆素含量為指標(biāo)，對(duì)大孔樹脂的種類及相應(yīng)的純化工藝進(jìn)行篩選，為確定生產(chǎn)工藝參數(shù)提供依據(jù)。

1 材料與裝置

UV1101型紫外分光光度儀（上海天美科學(xué)儀器有限公司）;BS－124S電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）;DW－2控溫電熱套（江蘇通州光學(xué)儀器有限公司）;水浴鍋（余姚市亞星儀器儀表有限公司）;SZ－93自動(dòng)雙重水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）;ZK－40AX電熱真空干燥箱（上海申光儀器儀表有限公司）;

黃花草木犀購(gòu)自寧夏綠博種子公司;D101－1樹脂（藥用級(jí)）;NKA－9樹脂（藥用級(jí)）;AB－8樹脂（藥用級(jí)），以上樹脂均購(gòu)自天津海光化工有限公司;蒸餾水實(shí)驗(yàn)室自制;香豆素對(duì)照品（購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司，A1079 Coumarin HPLC≥98%）;乙醇、NaOH均為AR級(jí)。

2 方法及結(jié)果分析

2.1 草木犀總香豆素的測(cè)定 精密稱取香豆素對(duì)照品5.2 mg，置25 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL置10 mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為0.020 8 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。從中量取1、2、3、4、5 mL分別定容至10 mL量瓶中。以乙醇為空白對(duì)照，在275 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程Y=80.865X+0.001，R2=0.999 3表明香豆素在0.002 08～0.010 4 mg/mL與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2 上柱液的制備 稱取草木犀藥材100 g，加500 mL 95%乙醇回流提取3 h，提取液回收至無(wú)乙醇味，加水定容至1 000 mL，超聲處理30 min，使其分散均勻，即得。

2.3 不同吸附樹脂對(duì)草木犀總香豆素的靜態(tài)吸附量試驗(yàn)

精密稱取已處理好的干樹脂約1 g，置100 mL燒杯中，加草木犀樣品溶液（質(zhì)量濃度1.66 mg/mL）20 mL，每隔10 min振搖20 s，持續(xù)3 h，然后靜置24 h，使其達(dá)到飽和吸附，吸取上層液測(cè)定總香豆素的質(zhì)量濃度。按下式計(jì)算樹脂飽和吸附量:飽和吸附量=

結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 3種樹脂靜態(tài)飽和吸附量測(cè)定結(jié)果（n=3）

2.4 不同樹脂對(duì)草木犀總香豆素靜態(tài)吸附－洗脫性能試驗(yàn)

結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3種樹脂靜態(tài)洗脫測(cè)定結(jié)果（n=3）

結(jié)果說(shuō)明除NKA－9對(duì)草木犀總香豆素的靜態(tài)吸附量較小外，另外兩種樹脂的吸附量均在28.5 mg/g以上，能用于草木犀總香豆素吸附分離工藝。在靜態(tài)洗脫中，D101－1型樹脂吸附的草木犀總香豆素較易洗脫，AB－8型樹脂的洗脫率相對(duì)較低，D101－1型樹脂表現(xiàn)出最佳的綜合性能。因而選用D101－1型樹脂分離純化草木犀總香豆素。

2.5 D101－1樹脂對(duì)草木犀總香豆素的動(dòng)態(tài)吸附性能與最大上樣量的考察 將濃度為0.1 g/mL的樣品液以1.0 mL/min的流速通過(guò)樹脂柱（樹脂干重為6 g，徑高比1∶7），分段收集殘留液，測(cè)定總香豆素含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 最大上樣量考察結(jié)果

動(dòng)態(tài)吸附性能考察結(jié)果:從泄露曲線可得第8流份殘留液中總香豆素明顯增多，說(shuō)明上樣至第7流份時(shí)總香豆素開(kāi)始明顯泄露。故確定草木犀樣品液的最大上樣量為5 g生藥/g干樹脂。

圖1 草木犀泄漏曲線

2.6 去雜溶劑種類與去雜性能的考察 分段（每段50 mL）收集蒸餾水、10%乙醇、20%乙醇的去雜洗脫液（上樣流速為1 mL/min，徑高比1∶7），測(cè)定其不同流份的總香豆素濃度，結(jié)果見(jiàn)表4，并繪制去雜曲線，見(jiàn)圖2。

表4 去雜溶劑種類考察結(jié)果（n=3）

圖2 不同去雜溶劑的去雜曲線

由去雜曲線可知，蒸餾水和10%乙醇洗脫液中草木犀總香豆素較少，當(dāng)乙醇濃度增大到20%時(shí)，總香豆素?fù)p失明顯，又因?yàn)?0%乙醇極性與樹脂極性更相似，故其去雜能力更強(qiáng)，所以確定300 mL10%乙醇為去雜溶劑（第6流份洗脫液基本為無(wú)色，故確定去雜溶劑體積為300 mL）。

2.7 洗脫劑種類與洗脫性能的考察 分段（每段50 mL）收集含0.5%NaOH的10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇的洗脫液（上樣流速為1 mL/min，徑高比1∶7），用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3～4，測(cè)定其不同流份的總香豆素濃度，結(jié)果見(jiàn)表5，并繪制洗脫曲線，見(jiàn)圖3。

表5 洗脫溶劑種類考察結(jié)果（n=3）

圖3 不同洗脫劑的洗脫曲線

含0.5%的乙醇溶液解析能力較強(qiáng)，當(dāng)乙醇濃度達(dá)30%時(shí)解析比較充分，因此選其為洗脫劑，又因?yàn)閺牡?流份開(kāi)始，解析的總香豆素明顯減少，故洗脫劑的用量為200 mL。2.8 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 取草木犀藥材粉末30 g，500 mL95%乙醇回流提取3 h，過(guò)濾，濾液回收乙醇至無(wú)乙醇味，加水定容至300 mL，將已處理好的6 g D101－1型大孔樹脂裝柱，以1.0 mL/min的流速將300 mL草木犀上柱液上大孔樹脂柱，靜置吸附30 min，后用300 mL10%乙醇以1.0 mL/min的流速去雜，棄除雜液，再用200 mL含0.5%NaOH的30%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，用稀鹽酸調(diào)pH值至3～4，回收乙醇，真空干燥得黃棕色粉末，后用無(wú)水乙醇洗滌，回收乙醇，真空干燥得產(chǎn)物為深棕色粉末，平行實(shí)驗(yàn)3份，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）

經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，RSD＜2%，工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

草木犀主要抗炎活性成分為香豆素類物質(zhì)，香豆素的α－吡喃酮環(huán)具有α－β－不飽和內(nèi)酯性質(zhì)，在稀堿液中漸漸水解成黃色溶液，生成順式鄰羥桂皮酸（coumarinic acid）的鹽。其鹽的水溶液一經(jīng)酸化即閉環(huán)恢復(fù)為內(nèi)酯。在這一過(guò)程中香豆素的分子形態(tài)發(fā)生變化，分子極性發(fā)生顯著改變，結(jié)合大孔樹脂分離純化原理設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)純化工藝，通過(guò)改變洗脫溶劑的pH值，使吸附在大孔樹脂上的香豆素轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖洁徚u桂皮酸形態(tài)，大孔樹脂對(duì)順式鄰羥桂皮酸的吸附能力變?nèi)?，?0%的乙醇即可很好解吸，通過(guò)調(diào)節(jié)洗脫液的pH值，可使順式鄰羥桂皮酸恢復(fù)到香豆素形態(tài)，即達(dá)到了純化目的，此方法為香豆素類物質(zhì)的純化提供了一個(gè)新思路。

又因?yàn)轫樖洁徚u桂皮酸不容易游離存在，長(zhǎng)時(shí)間堿液中放置或UV照射可轉(zhuǎn)為穩(wěn)定反式鄰羥桂皮酸，反式鄰羥桂皮酸在酸性環(huán)境中不易閉環(huán)恢復(fù)為內(nèi)酯，故解吸后的洗脫液因盡快調(diào)節(jié)pH值至3～4，同時(shí)實(shí)驗(yàn)應(yīng)在避光處進(jìn)行。

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