賁永光， 丘泰球， 李 康

（1.廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院，廣東廣州 510006;2.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510640）

關(guān)于用超聲提取中藥復(fù)方的文獻(xiàn)報(bào)道非常少見，現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道中，絕大多數(shù)采用單頻輻照方式。有關(guān)雙頻超聲輻照的聲化學(xué)反應(yīng)規(guī)律的基礎(chǔ)研究則是近年來的事，因其顯著地增加空化事件，減少駐波所造成的死角，提高聲化學(xué)產(chǎn)額，它已引起國際上不少研究單位的濃厚興趣。朱昌平［1］等用碘釋放法研究了28 kHz分別與0.87 kHz、1.06 kHz，1.7 kHz組成的雙頻超聲輻照的聲化學(xué)效應(yīng)。發(fā)現(xiàn)雙頻輻照增大聲化學(xué)產(chǎn)額存在著明顯的頻率效應(yīng)。沈壯志［2］等研究雙低頻超聲輻射對碘化鉀溶液碘釋放量影響的研究，結(jié)果表明雙頻輻射碘釋放量約為單頻的2倍，有的甚至高達(dá)5倍左右。曹雁平［3］等采用均勻設(shè)計(jì)研究28 kHz和40 kHz單頻超聲、雙頻組合超聲（先28 kHz超聲接著40 kHz超聲）和雙頻復(fù)合超聲（28 kHz超聲和40 kHz超聲同時(shí)工作）浸提綠茶多酚，結(jié)果表明:雙頻復(fù)合超聲浸取綠茶茶多酚在濃度、浸取率和浸取速率三個(gè)方面都優(yōu)于單頻超聲和雙頻組合超聲。在所研究的各種頻率組合情況下，雙頻同時(shí)輻照的綜合效應(yīng)均明顯大于各頻率單獨(dú)輻照效應(yīng)。徐飛［4］等用超聲提取復(fù)方六味地黃丸，研究發(fā)現(xiàn)超聲提取效果明顯優(yōu)于回流提取法，具有省時(shí)、省工、提取率高等特點(diǎn)。目前用雙頻復(fù)合超聲提取技術(shù)對中藥復(fù)方進(jìn)行提取工藝的研究及新藥開發(fā)還是一個(gè)空白。超聲技術(shù)提取中藥具有提取效率高、低溫、省時(shí)、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)，但目前幾乎局限于單味中藥的提取，而中醫(yī)用藥多以復(fù)方制劑為主，藥物發(fā)揮的是多成分、多靶點(diǎn)的綜合治療作用，使超聲技術(shù)受到了限制，中藥復(fù)方采用雙頻復(fù)合超聲提取技術(shù)目前還是個(gè)空白。

本實(shí)驗(yàn)選擇單味藥丹參、單味藥三七及由丹參和三七兩味藥組成的復(fù)方丹參三七作為研究對象，采用雙頻復(fù)合超聲（25 kHz/40 kHz）強(qiáng)化提取單味藥及復(fù)方中藥有效成分，并對單味藥和復(fù)方中藥的雙頻復(fù)合超聲提取效果進(jìn)行檢驗(yàn)分析。

1 儀器和材料

1.1 材料

丹參（批號:021116）和三七（批號:200207）藥材（廣州漢方現(xiàn)代中藥研究開發(fā)有限公司提供），丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)品（批號:110766－200314）和人參皂苷 Rg1（批號:0703－200120）對照品（中國藥品生物制品檢定所）;乙醇、甲醇、乙醚均為分析純。

1.2 儀器

超聲波清洗槽（槽式超聲，40 kHz，功率可調(diào)）;探頭式超聲波處理機(jī)（25 kHz，功率可調(diào)）;雙頻復(fù)合超聲化學(xué)反應(yīng)器（自制）;本實(shí)驗(yàn)雙頻復(fù)合超聲裝置為探頭式超聲與槽式超聲組合而成，25 kHz和40 kHz超聲同時(shí)開啟并作用于提取對象。HH－6恒溫水浴鍋（江蘇金壇市宏華儀器廠）;RE－52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市英峪予華儀器廠）;予華牌循環(huán)水真空泵（河南省鞏義市英峪予華儀器廠）;UV1101紫外/可見分光光度儀（上海天美科學(xué)儀器有限公司）;JA2003電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）;日本島津LC10ATVP型液相色譜儀。

1.3 雙頻復(fù)合超聲操作方法

雙頻復(fù)合超聲操作:25 kHz和40 kHz超聲同時(shí)開啟，40 kHz是槽式超聲，連續(xù)發(fā)射超聲，而25 kHz超聲是探頭式超聲，作用5 s，停5 s，為保證40 kHz和25 kHz超聲同步作用，40 kHz超聲作用時(shí)間結(jié)束，25 kHz超聲作用時(shí)間也結(jié)束，即同時(shí)停止超聲。單頻超聲操作:比如40 kHz超聲單頻作用，實(shí)驗(yàn)裝置與雙頻復(fù)合超聲相同，與雙頻復(fù)合超聲操作所不同的是:只開啟40 kHz超聲，而不開啟25 kHz超聲，目的是保持40 kHz超聲產(chǎn)生的聲場和雙頻復(fù)合超聲中40 kHz超聲產(chǎn)生的聲場是一致。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

丹參酮ⅡA的色譜條件:儀器為waters2695/2996，色譜柱為 Hypersil ODS 5 μm，250 mm ×4.6 mm，檢測波長 270 nm，流動(dòng)相為水－甲醇（25∶75），柱溫30℃，流速1 mL/min，分析時(shí)間 25 min，進(jìn)樣量 5 μL。

人參皂苷Rg1色譜條件:儀器為waters2695/2996，色譜柱為 Hypersil ODS 5 μm，250 mm ×4.6 mm，檢測波長 203 nm，流動(dòng)相為0.05 mol/L磷酸水溶液－乙腈（81∶19），柱溫30 ℃，流速1 mL/min，分析時(shí)間 60 min，進(jìn)樣量 10 μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

人參皂苷Rg1對照品溶液的制備:取對照品人參皂苷Rg1適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含80 μg的溶液作為對照品溶液。

丹參酮ⅡA對照品溶液的制備:對照品丹參酮ⅡA適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含16 μg的溶液作為對照品溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別精密吸取不同體積的丹參酮ⅡA對照品貯備液，用甲醇稀釋調(diào)配成系列對照品溶液，分別進(jìn)樣5 μL，測定峰面積積分值。以丹參酮ⅡA濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為:Y=5.73×106x－3.62×104，r=0.999 9，丹參酮ⅡA在濃度為 0.007 4～0.222 0 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

分別精密吸取不同體積的人參皂苷Rg1對照品貯備液，用甲醇稀釋調(diào)配成系列對照品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，測定峰面積積分值。以人參皂苷Rg1濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為:Y=3.31×105X－4.39×104，r=0.999 7，人參皂苷 Rg1在濃度為0.080～1.620 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 提取率的計(jì)算

按照復(fù)方配比（丹參/三七為4∶1）準(zhǔn)確稱取丹參粉末2.0 g，三七粉末0.5 g，將丹參和三七混勻。置索氏提取器中，加乙醚80 mL，水浴上提取2 h，取出，棄去乙醚液，再加甲醇80 mL提取4 h，提取液抽濾定容，按2.3項(xiàng)方法測定，計(jì)算提取液有效成分的含量，并以此計(jì)算出各處理的有效成分提取率。

2.5 單頻和雙頻復(fù)合超聲提取單味藥及復(fù)方中藥有效成分提取率對比

根據(jù)單頻超聲和雙頻復(fù)合超聲提取單方及復(fù)方工藝條件，本實(shí)驗(yàn)在此條件下進(jìn)行，即乙醇濃度95%，物料粒徑80～100目，固液比1∶15，提取時(shí)間40 min，提取溫度30℃，其中藥材量丹參為2 g，三七為0.5 g。結(jié)果見表1。

表1 在不同方法下提取單味藥及復(fù)方中藥有效成分提取率

從表1可以看出不同提取方法對單味藥提取時(shí)的有效成分的提取率均低于復(fù)方提取時(shí)的提取率，對于單頻和雙頻提取來說，整體效果更加突出，這就表明了單頻，雙頻復(fù)合超聲提取復(fù)方丹參三七的效果優(yōu)于單味藥提取，對于這樣的結(jié)果，從整體上看可以推測有幾種可能的原因:第一，當(dāng)復(fù)方超聲提取時(shí)，可能是因?yàn)樘崛×说牡⑼駻成分增強(qiáng)了超聲對人參皂苷Rg1提取的能力，或者是提取了的人參皂苷Rg1成分增強(qiáng)了超聲對丹參酮ⅡA提取的能力;第二，中藥復(fù)方有效成分比較多而且復(fù)雜，某些成分之間可能產(chǎn)生協(xié)同或者是互溶作用，從而導(dǎo)致目標(biāo)成分提取率的提高。第三，由于超聲的強(qiáng)剪切作用對復(fù)方藥材粉末進(jìn)一步粉碎到更細(xì)小的粒徑，從而增加傳質(zhì)表面積，使得傳質(zhì)速率提高。另外，從表中可以看出，雙頻復(fù)合超聲的提取效果又優(yōu)于單頻超聲的提取效果，這可能由于雙頻復(fù)合超聲產(chǎn)生的協(xié)同作用使得液體中的空化泡的數(shù)量增加，使得空化事件增多。另一方面，由于超聲發(fā)生空化時(shí)，在極短的時(shí)間、極小的空間內(nèi)可產(chǎn)生50 MPa以上的高壓，這足以引起空化點(diǎn)附近的溶劑形成超臨界狀態(tài)，這樣使得復(fù)方中的溶質(zhì)在溶劑中的溶解度顯著增大，導(dǎo)致溶質(zhì)在常態(tài)下變?yōu)檫^飽和，從而使傳質(zhì)推斷力變大，從而從整體上能強(qiáng)化傳質(zhì)速率。

2.6 利用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法對雙頻復(fù)合超聲提取單方及復(fù)方丹參三七的效果進(jìn)行檢驗(yàn)

為了檢驗(yàn)雙頻復(fù)合超聲對復(fù)方丹參三七及單味丹參和單味三七的提取效果數(shù)據(jù)之間的差異是否因?yàn)樵囼?yàn)過程中的測試誤差或者時(shí)其他原因而導(dǎo)致的，我們可以利用統(tǒng)計(jì)學(xué)中的平均值檢驗(yàn)方法對它們進(jìn)行顯著差異性檢驗(yàn)［5］。就是檢驗(yàn)在同樣的超聲條件提取下，測得的單方提取和復(fù)方提取有效成分的兩組提取率是否有顯著性差異，如果有兩組數(shù)據(jù)有顯著性差異，則說明超聲提取復(fù)方和單方的效果是不一樣的，否則，可以說明超聲提取復(fù)方和單方的效果沒有差異性，也就是復(fù)方和單方的超聲提取效果沒有明顯的差異。

根據(jù)雙頻復(fù)合超聲提取單方及復(fù)方工藝條件，本實(shí)驗(yàn)在此條件下進(jìn)行，即乙醇濃度95%，物料粒徑80～100目，固液比1∶15，提取時(shí)間40 min，提取溫度30℃，其中藥材量丹參為2 g，三七為0.5 g。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)做5次。雙頻復(fù)合超聲提取單味丹參、三七及復(fù)方得出的丹參酮ⅡA和人參皂苷Rg1含量均用HPLC進(jìn)行測定，測定結(jié)果見圖1及表2。

從圖1可以看出，雙頻復(fù)合（25 kHz/40 kHz）提取復(fù)方時(shí)的目標(biāo)成分丹參酮ⅡA和人參皂苷Rg1的提取率均高于單味丹參和單味三七的目標(biāo)成分。從表2可以看出，對A組和B組、C組和D組進(jìn)行顯著差異性檢驗(yàn)結(jié)果可知，A組和B組、C組和D測定的結(jié)果都存在顯著性差異，說明了超聲提取復(fù)方丹參三七和單味藥丹參及單味藥三七的效果是不一樣的，而且雙頻復(fù)合超聲提取的復(fù)方丹參三七的有效成分的效果優(yōu)于單味藥丹參和單味藥三七。通過這樣的比較，我們可以知道，單味藥丹參和單味藥三七混合起來提?。ㄒ部梢哉f為整提）所得的有效成分提取率高于各單味藥提?。ㄒ部梢哉f為分提），另外，由于超聲提取具有低溫的優(yōu)點(diǎn)，有效成分不會(huì)發(fā)生分解，從而保持了有效成分的活性。

圖1 以丹參酮ⅡA和人參皂苷Rg1為指標(biāo)的單方及復(fù)方的雙頻復(fù)合超聲提取

3 討論

目前超聲提取技術(shù)應(yīng)用于中藥材的提取具有很多優(yōu)點(diǎn)，但是這些大部分只是針對單味藥材的提取。中藥復(fù)方是中醫(yī)用方處藥的一大特點(diǎn)，不同的藥材組織結(jié)構(gòu)，具有不同的最佳提取參數(shù)，而不同的有效成分，也有不同的最佳提取參數(shù)。中藥復(fù)方由多味藥組成，方中每味藥都有可能具備不同的組織結(jié)構(gòu)，且其所含有效成分多而復(fù)雜，應(yīng)用超聲技術(shù)能否將其最大限度的提取出來，是否也具有省時(shí)、省工、高效等優(yōu)點(diǎn)，還需大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，但這些目前尚未有公開的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)就是針對此問題進(jìn)行的研究，但只進(jìn)行了一類中藥復(fù)方（復(fù)方丹參三七）的超聲提取研究，研究結(jié)果表明:從提取效率方面來說，雙頻復(fù)合超聲對復(fù)方丹參三七中的兩種有效成分丹參酮ⅡA和人參皂苷Rg1的提取效果是很好的，說明了超聲技術(shù)同樣適用于該類復(fù)方。

從本實(shí)驗(yàn)可以看出，超聲提取丹參酮ⅡA和人參皂苷Rg1的影響工藝參數(shù)及規(guī)律是相似的，這與它們的物理性質(zhì)也許會(huì)有一定的關(guān)系，而且這些有效成分在乙醇溶劑中的溶解度都是很大的，這就有利于提取溶劑的選擇，從而更有利于進(jìn)行整體提取，而且也利于將復(fù)方中的有效成分盡可能的全部提取出來。另外復(fù)方中的有效成分比較多，而且復(fù)雜，針對不同的有效成分，運(yùn)用單頻超聲要將其全部有效成分提取出來是困難的，隨著超聲波技術(shù)的發(fā)展，雙頻、多頻或者可調(diào)頻超聲波技術(shù)為解決這一問題提供了可能。當(dāng)然，復(fù)方中藥本身作用機(jī)制就很復(fù)雜，而且各有效成分之間會(huì)產(chǎn)生互溶或者發(fā)生反應(yīng)，這些因素都會(huì)對中藥復(fù)方的提取有一定的影響，因此要找到超聲提取技術(shù)在中藥復(fù)方中的應(yīng)用范圍，確定其的適用性，還需要大量的中藥復(fù)方超聲提取研究。此外，超聲技術(shù)用于中藥復(fù)方的工業(yè)化大生產(chǎn)，是否也具可行性，更需要進(jìn)一步的研究。

表2 雙頻復(fù)合超聲提取單味藥和復(fù)方丹參三七的有效成分提取率對照分析

［1］朱昌平，馮 若，陳兆華，等.雙頻輻照的聲化學(xué)產(chǎn)額及其頻率效應(yīng)的研究［J］.南京大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，34（1）:93－96.

［2］沈壯志，尚志遠(yuǎn).雙低頻超聲輻射對碘化鉀溶液碘釋放量影響的研究［J］.陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1999，27（1）:51－53.

［3］曹雁平，李建宇，朱桂清，等.綠茶茶多酚的雙頻超聲浸取研究［J］.食品科學(xué)，2004，25（10）:139－144.

［4］徐 飛，尹蓉莉，鐘 玲，等.超聲提取六味地黃丸復(fù)方的工藝研究［J］. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2006，17（8）:1431－1433.

［5］鄧 勃.分析測試數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理方法［M］.北京:清華大學(xué)出版社.1995:78－80.