董春永， 張學(xué)蘭， 李慧芬

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250355）

荷葉為睡蓮科植物蓮Nelumbo nuciferaGaertn.的干燥葉，具有清熱解暑，升發(fā)清陽，涼血止血的功效［1］?，F(xiàn)代對荷葉的炮制方法主要有煅炭［1］和炒炭［2］兩種。研究表明，荷葉中主要含有生物堿、黃酮類、有機(jī)酸等成分。生物堿類成分有荷葉堿、原荷葉堿、N－去甲荷葉堿、蓮堿等;黃酮類成分有金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、蓮苷等;有機(jī)酸類成分有酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸等［3，4］。炮制對荷葉中荷葉堿和槲皮素含量有何影響，尚未見報(bào)道。本研究以荷葉堿和槲皮素含量為指標(biāo)，對荷葉生品、煅炭品及炒炭品進(jìn)行比較，為探討荷葉的炮制機(jī)理、篩選優(yōu)化荷葉飲片的炮制工藝，提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器和試藥

Agilent1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司）;FA1604N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）;PM PLUS型紅外測溫儀（美國 Raytek公司）;多星電炒鍋（淄博多星電器集團(tuán)有限責(zé)任公司）。

荷葉購自濟(jì)南市建聯(lián)中藥店，經(jīng)本校周鳳琴教授鑒定為睡蓮科植物蓮Nelumbo nuciferaGaertn.的干燥葉經(jīng)加工而成的絲狀片，產(chǎn)地山東。煅荷葉炭:按《中國藥典》2005年版一部荷葉項(xiàng)下方法依法炮制［1］。取凈荷葉絲50 g，置電炒鍋內(nèi)，密封，230 ℃煅制3 h，放涼，取出。成品表面烏黑色。炒荷葉炭:按《山東省中藥炮制規(guī)范》2002年版荷葉項(xiàng)下方法依法炮制［2］。取凈荷葉絲50 g，置電炒鍋內(nèi)，280℃（用紅外測溫儀測定鍋底溫度）炒制5 min，取出，放涼。成品表面烏黑色。荷葉堿、槲皮素對照品（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號(hào)為111566－200402、100081－200406）;高效液相用乙腈、甲醇（色譜純）;其余試劑均為A.R。

2 方法與結(jié)果

2.1 水分含量測定 取各樣品粗粉約2 g，精密稱定，按《中國藥典》2005年版一部附錄Ⅸ H水分測定法（烘干法）測定（n=3），結(jié)果生荷葉、煅荷葉炭及炒荷葉炭的水分含量依次為10.44%、4.31%、4.21%。按干燥品計(jì)算樣品中各指標(biāo)成分的含量。

2.2 荷葉堿含量測定［1］

2.2.1 供試品溶液的制備 取各樣品粗粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流2.5 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.2 對照品溶液制備 取荷葉堿對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成濃度為1.355 mg/mL的溶液，搖勻，即得。

2.2.3 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18，200 mm×4.6 mm;流動(dòng)相∶乙腈－水－三乙胺－冰醋酸（27∶70.6∶1.6∶0.78）;流速:1 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:270 nm。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取荷葉堿對照品溶液0.1、0.5、1、2、3 mL，分別置 10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。各取20 μL注入液相色譜儀，測定峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，作線性回歸，結(jié)果荷葉堿在 2.71 μg/mL ～81.30 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=67.02X+21.26，r=0.999 9。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取生荷葉供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果6次測得荷葉堿峰面積的 RSD為1.22%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取生荷葉供試品溶液，在室溫下自然放置，分別在 0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)行測定，結(jié)果6次測得荷葉堿峰面積的RSD為1.32%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取生荷葉樣品，平行6份，按供試品溶液制備方法制備并測定，結(jié)果6次測得荷葉堿含量的RSD為1.38%。表明測定方法重復(fù)性良好。

2.2.8 樣品含量測定 取各樣品粗粉，按2.2.1項(xiàng)下方法分別制得供試品溶液，分別精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，記錄荷葉堿峰面積，分別代入回歸方程計(jì)算荷葉堿含量，色譜圖見圖1，結(jié)果見表1。

圖1 荷葉堿對照品（A）、荷葉生品（B）、荷葉煅炭品（C）、荷葉炒炭品（D）HPLC圖

表1 荷葉不同炮制品中荷葉堿和槲皮素含量比較（n=3）

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已測知荷葉堿含量的生荷葉粗粉共6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別精密加入荷葉堿對照品溶液（0.271 mg/mL）5 mL，按2.2.1項(xiàng)下方法制得供試品溶液，分別精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，記錄荷葉堿峰面積，計(jì)算含量和回收率，結(jié)果其平均回收率為99.57%，RSD為1.13%。

2.3 槲皮素含量測定［5］

2.3.1 供試品溶液制備 取各樣品粗粉約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用60%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.3.2 對照品溶液制備 取槲皮素對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成濃度為1.000 mg/mL的溶液，搖勻，即得。

2.3.3 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18;200 mm×4.6 mm;流動(dòng)相∶甲醇－0.2%磷酸溶液（55∶45）;流速:1 mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:360 nm。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取荷葉堿對照品溶液0.1、0.5、1、2、3 mL，分別置5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。各取20 μL注入液相色譜儀，測定峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，作線性回歸，結(jié)果槲皮素在0.02 mg/mL～0.6 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=10 116X+23.717，r=0.999 9。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 取炒荷葉炭供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果6次測得荷葉堿平均峰面積的RSD為1.34%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取炒荷葉炭供試品溶液，在室溫下避光自然放置，分別在 0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)行測定，結(jié)果荷葉堿平均峰面積的RSD為1.12%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取炒荷葉炭樣品，平行6份，按供試品溶液制備方法制備并測定，結(jié)果荷葉堿平均含量的RSD為1.31%。表明測定方法重復(fù)性良好。

2.3.8 樣品含量測定 取各樣品粗粉，按2.3.1項(xiàng)下方法分別制得供試品溶液，分別精密吸取20μL，注入液相色譜儀，記錄槲皮素峰面積，分別代入回歸方程計(jì)算槲皮素含量，色譜圖見圖2，結(jié)果見表1。

圖2 槲皮素對照品（A）、荷葉生品（B）、荷葉煅炭品（C）、荷葉炒炭品（D）HPLC圖

2.3.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已測知含量的炒荷葉炭粗粉，共6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別精密加入槲皮素對照品溶液（6.75 mg/mL）1 mL，按2.3.1項(xiàng)下方法制得供試品溶液，分別精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，記錄槲皮素峰面積，計(jì)算含量和回收率，結(jié)果其平均回收率為98.69%，RSD為1.23%。

3 小結(jié)和討論

3.1 測定了荷葉生品、煅炭品和炒炭品中荷葉堿和槲皮素含量，結(jié)果表明，荷葉經(jīng)煅炭或炒炭后，荷葉堿損失殆盡，而槲皮素含量較生品增加6倍多。說明加熱炮制對荷葉中荷葉堿和槲皮素含量有顯著影響。本研究結(jié)果為荷葉飲片的炮制和質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3.2 荷葉堿的熔點(diǎn)較低為165℃，荷葉制炭后荷葉堿含量大幅度降低分析是由于經(jīng)高溫加熱使荷葉堿受熱破壞所致。荷葉中槲皮素多以結(jié)合苷的形式存在［6］，荷葉中的金絲桃苷、異槲皮苷的熔點(diǎn)依次為197～199℃和198～200℃，二者的苷元均為槲皮素，荷葉制炭后槲皮素含量顯著升高，分析可能與金絲桃苷和異槲皮苷受熱后分解生成槲皮素有關(guān)，對此有待進(jìn)一步深入研究。

3.3 傳統(tǒng)認(rèn)為，生荷葉長于清熱解暑、升發(fā)清陽，制炭后可增強(qiáng)其止血作用［7］。藥理研究表明，荷葉堿可明顯降低小鼠血清中甘油三酯和膽固醇的含量［8］，槲皮素對二磷酸腺苷、膠原、鈣離子載體和花生四烯酸等誘導(dǎo)劑引起的人血小板聚集反應(yīng)有顯著的抑制作用［9］。荷葉制炭后止血作用增強(qiáng)分析與槲皮素含量增加有關(guān)，而荷葉制炭后荷葉堿含量降低與其止血作用增強(qiáng)有何關(guān)系有待進(jìn)一步研究探討。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:195.

［2］山東省藥品監(jiān)督管理局·山東省中藥炮制規(guī)范［M］.濟(jì)南:山東友誼出版社，2002:336.

［3］劉淑萍，樊淑彥，侯海妮，等.荷葉化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25（4）:254－256.

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［5］雍國新.荷葉中槲皮素提取工藝研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（14）:5705－5706.

［6］鄔曉鷗，熊 英.荷葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2004，18（4）:27－29.

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