李俊松， 劉訓(xùn)紅， 張?jiān)聥龋?蔡寶昌， 尹 娣

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210029）

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalisSiebl.et Zucc.的干燥成熟果肉。臨床上多用酒山萸肉。山萸肉長于斂汗固脫，用于自汗或大汗不止，陰虛盜汗;經(jīng)酒蒸制后，補(bǔ)益肝腎作用增強(qiáng)，常用于眩暈耳鳴，陽痿遺精，遺尿，尿頻，月經(jīng)過多或崩漏，腰部酸痛等［1］。另外還有清蒸品，滋補(bǔ)作用弱于酒蒸品［2］?，F(xiàn)代研究表明，環(huán)烯醚萜苷、有機(jī)酸、多糖、鞣質(zhì)等是山茱萸的有效成分。環(huán)烯醚萜苷成分如獐牙菜苷有抗肝細(xì)胞損傷作用［3］，馬錢苷對免疫反應(yīng)有雙向調(diào)節(jié)作用、對半乳糖胺所致肝損傷的保護(hù)作用、對艾氏腹水瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、人骨髓瘤細(xì)胞SP20均有一定的保護(hù)作用［4］。

山茱萸的質(zhì)量控制，《中國藥典》2005版規(guī)定以馬錢苷為控制指標(biāo)，采用高效液相色譜法測定，文獻(xiàn)也多采用高效液相色譜法測定山茱萸中環(huán)烯醚萜含量［5－7］，紫外法分光光度法測定山茱萸環(huán)烯醚萜苷總苷含量也有報(bào)道［8］。

本實(shí)驗(yàn)采用高效毛細(xì)管電泳法進(jìn)行了山茱萸飲片中環(huán)烯醚萜苷的測定方法研究。實(shí)驗(yàn)中選擇硼砂溶液為緩沖液，對獐牙菜苷和馬錢苷的毛細(xì)管電泳遷移行為進(jìn)行了研究，并考察了緩沖溶液濃度、表面活性劑濃度、有機(jī)溶劑、緩沖溶液pH、運(yùn)行電壓、運(yùn)行溫度等因素對待測物質(zhì)分離的影響，建立了一種簡單、快速、能同時(shí)分離測定山茱萸飲片中獐牙菜苷和馬錢苷含量的毛細(xì)管電泳分析新方法。

1 儀器與試劑

Agilent型高效毛細(xì)管電泳儀（型號:G1600 AX），包括惠普化學(xué)工作站，DAD檢測器，自動(dòng)進(jìn)樣器;BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（型號:Rotavapor R－3）;AG 285電子天平;PHS－3C型PH計(jì)（上?？祪x儀器有限公司）;KQ－500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

獐牙菜苷對照品（江蘇省藥物研究所制備）;馬錢苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號:111640－200503）。其他化學(xué)試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。山茱萸酒制品為不同產(chǎn)地藥材加工或商品飲片，編號:S1－河南 （080625），S2－陜西（080626），S3－浙 江 臨 安 （080627），S4－安 徽（081201），S5－山西（081201），S1－S3 由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠按2005年版《中國藥典》加工制得，S4－S5由亳州市中藥飲片廠按2005年版《中國藥典》加工制得，S6－S7 由南京國醫(yī)堂提供，S8－S9 由南京百草堂提供，S10－傳統(tǒng)中醫(yī)門診部提供;山茱萸生品編號:S11－河南（Y080625），S12－陜西（Y080626）。均經(jīng)作者鑒定為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalisSiebl.et Zucc.的干燥成熟果肉。

2 方法與結(jié)果

2.1 電泳條件 未涂漬標(biāo)準(zhǔn)熔融石英毛細(xì)管（75 μm i.d.×64.5 cm，有效長度56 cm）（Agilent科技有限公司）;檢測波長:240 nm;壓力進(jìn)樣:5 kPa×8 s;分離電壓:10 kV;毛細(xì)管溫度:18℃;運(yùn)行緩沖液50 mmol/L 硼砂－40 mmol/L SDS－5%乙腈 （pH 9.5）。毛細(xì)管使用前以0.1 mmol/L氫氧化鈉溶液、超純水和運(yùn)行緩沖液依次通過壓力沖洗5、10、5 min。

2.2 對照品溶液的制備 以80%甲醇溶液為溶劑，配置獐牙菜苷、馬錢苷混合對照品貯備液（獐牙菜苷192.5 mg/L、馬錢苷1 210 mg/L），在冰箱中保存。在使用前，精密量取上述混合對照品貯備液1、2、4、6、10 mL 于10 mL 量瓶中，80%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜過濾，作為不同濃度的工作溶液。

2.3 供試品溶液的配制 取山茱萸粉末1 g（過50目篩），至100 mL量瓶中，精密稱定，加80%甲醇50 mL，精密稱定，浸漬1 h后，超聲提取60 min，放冷，再精密稱定，以80%甲醇補(bǔ)足其重量，搖勻，濾過。取濾液30 mL，水浴蒸干，80%甲醇溶解并定容至5 mL，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 取上述獐牙菜苷、馬錢苷不同濃度的工作溶液，在選定的電泳優(yōu)化條件下，測定，以對照品的峰面積（Y）對相應(yīng)的濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，相關(guān)系數(shù)及線性范圍;以信噪比S/N=3對應(yīng)濃度確定最低檢測限（LOD），以信噪比S/N=10對應(yīng)濃度確定最低定量限（LOQ）。見表1。

表1 獐牙菜苷與馬錢苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限與定量限（n=2）

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn) 在選定的電泳優(yōu)化條件下，將混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，獐牙菜苷的遷移時(shí)間RSD為0.63%，峰面積RSD為1.38%;馬錢苷的遷移時(shí)間RSD為0.72%，峰面積RSD為1.98%。取上述混合對照品溶液，分別于0、1、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣，獐牙菜苷的遷移時(shí)間 RSD為1.21%，峰面積RSD為2.31%;馬錢苷的遷移時(shí)間RSD為0.92%，峰面積RSD為2.30%。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取河南酒制品（S1）5份，精密稱定，按照2.3項(xiàng)下方法，分別制備供試液，在選定的電泳條件下，測定，獐牙菜苷的遷移時(shí)間RSD為1.63%，峰面積RSD為2.51%;馬錢苷的遷移時(shí)間RSD為1.72%，峰面積RSD為2.38%。

2.5.3 回收率試驗(yàn) 精密稱定河南酒制品（S1）5份，加入混合標(biāo)準(zhǔn)品各2 mL，按照2.3項(xiàng)下方法，制備供試液，在選定的電泳條件下，測定，以外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算含量，獐牙菜苷與馬錢苷回收率分別為100.38%，100.41%;RSD分別為2.80%、2.98%，表明該方法可靠。

2.6 樣品測定 在選定的電泳優(yōu)化條件下，將供試品溶液注入高效毛細(xì)管電泳儀中，進(jìn)行測定，以外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算含量，對照品和山茱萸樣品HPCE－DAD色譜圖見圖1，根據(jù)相應(yīng)的線性關(guān)系計(jì)算樣品中獐牙菜苷與馬錢苷含量，結(jié)果見表2。

表2 HPCE法測定山茱萸分析結(jié)果（n=4）

圖1 對照品溶液和山茱萸樣品HPEC-DAD色譜圖

3 結(jié)論與討論

3.1 電泳條件的優(yōu)化 毛細(xì)管電泳（HPCE）的分離選擇性及分離效率主要取決于緩沖液的類型、酸度、濃度，緩沖液添加劑、電壓、溫度等也有一定影響。實(shí)驗(yàn)對山茱萸飲片中的獐牙菜苷、馬錢苷進(jìn)行了分離研究，重點(diǎn)考察了緩沖溶液濃度、表面活性劑濃度、有機(jī)溶劑、緩沖溶液pH、運(yùn)行電壓、運(yùn)行溫度等實(shí)驗(yàn)條件對分離的影響。

3.1.1 緩沖液體系的選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了硼砂，乙酸銨，硼砂－SDS及硼砂－SDS－乙腈體系的緩沖溶液，發(fā)現(xiàn)選用硼砂緩沖液或乙酸銨緩沖液時(shí)，獐牙菜苷及馬錢苷分離度很差，基本不能分開，但當(dāng)在硼砂緩沖液中加入SDS，分離有所改善，但是獐牙菜苷及馬錢苷分離度還是不能達(dá)到Rs≥1.5的要求，故需要加入有機(jī)溶劑以增加樣品溶液中非水物質(zhì)的溶解度，同時(shí)也會(huì)影響膠束相和流動(dòng)相的性質(zhì)，進(jìn)而改變?nèi)苜|(zhì)在水相和膠束相的分配比例，有利于提高分離效率，當(dāng)加入乙腈后分離度變好，Rs＞1.5。故選擇硼砂－SDS－乙腈緩沖體系。

3.1.2 硼砂濃度的影響 緩沖液濃度是影響被測物遷移時(shí)間和分離度的一個(gè)重要因素，這是因?yàn)榫彌_液的濃度決定了溶液的黏度系數(shù)、溶質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)以及毛細(xì)管內(nèi)壁的ξ電位。本實(shí)驗(yàn)考察了8～50 mmol/L的硼砂緩沖溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)遷移時(shí)間和分離度隨著緩沖液濃度的升高而增大。當(dāng)緩沖液濃度到50 mmol/L時(shí)對照品的峰形和分離度最佳。

3.1.3 SDS 濃度的影響 考察了10、15、20、25、30、35、40 mmol/L 7個(gè)SDS濃度下的分離情況，當(dāng)SDS濃度為40 mmol/L時(shí)，山茱萸中成分的分離情況較理想，且被測組分的峰形及遷移時(shí)間較好。

3.1.4 乙腈濃度的影響 在膠束電泳（MECC）中，乙腈作為有機(jī)添加劑，有利于提高憎水溶質(zhì)在水相中的溶解性，并且會(huì)影響膠束相和流動(dòng)相的性質(zhì)，進(jìn)而改變了溶質(zhì)在水相和膠束相的分配比例，有利于提高分離效率。實(shí)驗(yàn)考察了5%、10%、15%、20%（V/V）乙腈濃度對山茱萸中成分分離的影響，發(fā)現(xiàn)乙腈濃度為5%時(shí)，峰形較好，且各組分的分離也達(dá)到 Rs＞1.5。

3.1.5 緩沖溶液pH的選擇 緩沖液的pH直接影響毛細(xì)管表面的ξ電勢，從而影響電滲流的方向和速度，同時(shí)溶液的pH也決定樣品中各組分分子的表面電荷數(shù)，從而影響組分的遷移時(shí)間和分離度，故本實(shí)驗(yàn)對緩沖液的pH進(jìn)行了優(yōu)化選擇以獲得較好的分離條件。考察了pH 8.8～9.5的緩沖液，發(fā)現(xiàn)隨著pH值的增大，各組分的分離度增加而遷移時(shí)間延長，峰高亦增高，當(dāng)pH為9.5時(shí)被測組分可達(dá)到基線基本分離。

3.1.6 運(yùn)行電壓的選擇 實(shí)驗(yàn)在分離電壓10～22 kV的條件下考察了對各組分遷移時(shí)間的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分離電壓越高，組分的遷移時(shí)間越短，不利于分離，當(dāng)分離電壓為10 kV時(shí)樣品及對照品各待測組分可以達(dá)到基線基本分離。

3.1.7 運(yùn)行溫度的選擇 毛細(xì)管電泳中，運(yùn)行溫度也影響電場的強(qiáng)度，從而影響電滲流速度和帶電物質(zhì)的遷移速率，影響分析物的遷移時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)考察了運(yùn)行溫度15～30℃的條件下對各組分遷移時(shí)間的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明運(yùn)行溫度越高，組分的遷移時(shí)間越短，但當(dāng)運(yùn)行溫度為18℃時(shí)樣品的各組分分離效果好，且分析時(shí)間縮短。

3.1.8 檢測波長的選擇 取山茱萸樣品，按選定制備供試品溶液，電泳條件進(jìn)樣，在190～600 nm處三維圖譜，結(jié)果表明240 nm各峰分離最好，因此，選擇240 nm作為檢測波長。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同產(chǎn)地或商品山茱萸酒制品中獐牙菜苷與馬錢苷的含量具有一定差異，其中馬錢苷以河南、陜西及安徽產(chǎn)的飲片較高，所有樣品中獐牙菜苷含量均很低或未檢出。山茱萸生品與相對應(yīng)的酒制品中獐牙菜苷與馬錢苷的含量也有差異，獐牙菜苷酒制后有所增加，馬錢苷以酒制品升高或變化不明顯，其炮制過程中含量變化規(guī)律仍需進(jìn)一步探討。

3.3 本實(shí)驗(yàn)建立膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜二極管陣列檢測法（MEKC－DAD）同時(shí)測定山茱萸飲片中獐牙菜苷及馬錢苷含量，該方法簡便、靈敏，重復(fù)性好，可用于山茱萸飲片內(nèi)在質(zhì)量分析的評價(jià)與控制。

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