武娟霞， 王志祥， 余祥英， 信秀靈， 杜起光

（中國(guó)藥科大學(xué)制藥工程教研室，江蘇南京 210009）

牛蒡子（Fructus arctii）為牛蒡（Arctium lappaL.）的干燥成熟果實(shí)，而牛蒡苷（Arctiin、ARC）、牛蒡苷元（Arctigenin、ARC－G）是牛蒡子的主要有效成分［1］，具有抗菌、抗腫瘤、降血糖、抑制血小板以及抗衰老等方面的作用［2］。

文獻(xiàn)報(bào)道的牛蒡苷和牛蒡苷元的提取方法主要包括傳統(tǒng)的提取方法［3］以及超臨界萃取法［4］。但傳統(tǒng)提取方法的提取時(shí)間一般較長(zhǎng)，提取效率低;而超臨界萃取法須將極性較大的牛蒡苷水解為極性較小的牛蒡苷元才能提取的較為完全，提取步驟比較繁瑣。而超聲波作為一種新型的提取技術(shù)，具有簡(jiǎn)單、高效、低成本、高收率等特點(diǎn)。本文對(duì)超聲波提取牛蒡子中牛蒡苷和牛蒡苷元的工藝進(jìn)行了研究，著重考察了超聲功率、藥材粒徑、液固比、提取時(shí)間、提取溫度以及占空比等因素對(duì)牛蒡苷及牛蒡苷元提取率的影響，并通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了工藝條件。

1 儀器和材料

1.1 儀器

超聲波提取設(shè)備（北京弘祥隆超聲波提取設(shè)備有限公司），島津LC－10ATvp高效液相色譜儀（日本島津公司），JY1002型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器廠），F(xiàn)W100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司），SHZ－D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）。

1.2 材料

藥材牛蒡子（購(gòu)自安徽省亳州市華申藥業(yè)有限公司），牛蒡苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)110819－200606，中國(guó)藥品生物制品檢定所），牛蒡苷元標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)081026，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司），乙醇（工業(yè)級(jí)，南京化學(xué)試劑有限公司），甲醇（色譜純，南京化學(xué)試劑有限公司），純凈水（樂(lè)百氏（無(wú)錫）食品材料有限公司），去離子水（實(shí)驗(yàn)室自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析方法

將牛蒡子進(jìn)行粉碎，分別經(jīng)過(guò)10目、20目、40目、60目、80目、100目及120目篩，各取等量混勻備用。稱取牛蒡子粉末至超聲提取器的反應(yīng)杯中，加入50%乙醇溶液后，超聲提取，過(guò)濾得上清液，用移液槍精密量取提取液200 μL，置于5 mL量瓶中，用流動(dòng)相定容，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣到高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 牛蒡苷、牛蒡苷元色譜圖

色譜條件為:VP－ODS色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇－水，流速為 0.6 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，柱溫為25℃。

采用梯度洗脫，具體流動(dòng)相組成如表1所示。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取牛蒡苷標(biāo)準(zhǔn)品8.06 mg，牛蒡苷元標(biāo)準(zhǔn)品2.40 mg，分別用甲醇溶解后用流動(dòng)相定容于10 mL量瓶中，搖勻。經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾后分別取樣進(jìn)樣，記錄色譜圖。

表1 梯度洗脫流動(dòng)相組成

以峰面積分值/1 000為縱坐標(biāo)（Y），樣品濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，牛蒡苷及牛蒡苷元分別在40.31～806.2 μg/mL、15.00～240.00 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。通過(guò)線性回歸得回歸方程分別為:牛蒡苷:Y=－89.200 35+17.803 5X;牛蒡苷元:Y=68.196 99+27.859 1X。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批號(hào)牛蒡子顆粒5份，按供試品溶液制備法制備，并按以上色譜條件測(cè)試，RSDARC為4.47% ，RSDARC－G為 5.10%（n=5）。

2.4 單因素對(duì)牛蒡苷和牛蒡苷元提取率的影響

2.4.1 提取溫度的影響

以10～120目混合粒徑的牛蒡子藥材為原料，以50%乙醇為溶劑，在超聲功率為400 W，占空比為2∶3，液固比為10 mL/g，提取時(shí)間為20 min的條件下，選擇不同的提取溫度進(jìn)行試驗(yàn)。其結(jié)果如圖2所示，隨著溫度的升高，牛蒡苷和牛蒡苷元的收率均逐漸增大，當(dāng)溫度達(dá)到50℃后，收率均隨溫度的升高而逐漸降低。這是由于溫度升高促進(jìn)有效成分的擴(kuò)散，但由于牛蒡苷和牛蒡苷元對(duì)熱不太穩(wěn)定，溫度太高反而會(huì)使收率降低。此外溫度過(guò)高時(shí)還會(huì)使雜質(zhì)的溶出增多，增加分離難度?？梢?jiàn)牛蒡苷和牛蒡苷元的適宜提取溫度均為50℃。見(jiàn)圖2。

圖2 溫度對(duì)牛蒡苷和牛蒡苷元提取率的影響

2.4.2 占空比的影響

占空比的概念最初是在電學(xué)領(lǐng)域提出的，表示在一段連續(xù)工作時(shí)間內(nèi)脈沖（高電平）占用的時(shí)間與總時(shí)間的比值。近幾年來(lái)，超聲波技術(shù)也引入這一概念用來(lái)表示在間歇式的超聲作用時(shí)，超聲作用時(shí)間與總時(shí)間周期的比值。

以10～120目混合粒徑的牛蒡子藥材為原料，以50%乙醇為溶劑，在超聲功率為400 W，液固比為10 mL/g，提取溫度為50℃，提取時(shí)間為20 min的條件下，選擇不同的占空比進(jìn)行試驗(yàn)。其結(jié)果如圖3所示，連續(xù)超聲作用時(shí)，牛蒡苷的提取率為5.47%，牛蒡苷元提取率為1.14%，均低于間歇式超聲作用?？梢?jiàn)，占空比對(duì)超聲提取牛蒡苷和牛蒡苷元影響顯著，但其影響變化規(guī)律不顯著。其作用機(jī)制還有待于今后進(jìn)一步研究。見(jiàn)圖3。

圖3 占空比對(duì)牛蒡苷和牛蒡苷元提取率的影響

2.4.3 液固比的影響

以10～120目混合粒徑的牛蒡子藥材為原料，以50%乙醇為溶劑，在超聲功率為400 W，占空比為2∶3，提取溫度為50℃，提取時(shí)間為20 min的條件下，選擇不同的液固比進(jìn)行試驗(yàn)。其結(jié)果如圖4所示，逐漸增大液固比，牛蒡苷和牛蒡苷元的提取率也隨之增大，這是由于液固比的增大使溶液中濃度梯度增大，有利于物質(zhì)的溶出和擴(kuò)散。但在液固比達(dá)到14 mL/g之后，增大的趨勢(shì)逐漸趨于平緩，這說(shuō)明此時(shí)提取已經(jīng)充分，再增大液固比對(duì)提高提取率的作用已經(jīng)不大。見(jiàn)圖4。

圖4 液固比對(duì)牛蒡苷和牛蒡苷元提取率的影響

2.4.4 藥材粒徑的影響

以50%乙醇為溶劑，在超聲功率為400 W，占空比為2∶3，液固比為10 mL/g，提取溫度為50℃，提取時(shí)間為20 min的條件下，選擇不同粒徑的牛蒡子藥材為原料進(jìn)行試驗(yàn)。其結(jié)果如圖5所示，藥材粒徑對(duì)牛蒡苷和牛蒡苷元的提取率都有十分顯著的影響，兩者的提取率均隨粒徑的減小而增大，這是由于藥材粒度減小，傳質(zhì)表面積增大，對(duì)物質(zhì)的溶出有促進(jìn)作用。當(dāng)粒徑達(dá)到80～100目時(shí)，提取率達(dá)到最大;之后隨粒徑的減小而降低，這是由于當(dāng)藥材粒徑過(guò)小的時(shí)候，藥材細(xì)胞已經(jīng)被破壞，超聲波的空化效應(yīng)對(duì)其作用不明顯，并且由于顆粒過(guò)小吸附作用增強(qiáng)，所以提取率又有所降低。見(jiàn)圖5。

圖5 藥材粒徑對(duì)牛蒡苷和牛蒡苷元提取率的影響

2.4.5 提取時(shí)間的影響

以10～120目混合粒徑的牛蒡子藥材為原料，以50%乙醇為溶劑，在超聲功率為400 W，占空比為2∶3，液固比為10 mL/g，提取溫度50℃的條件下，選擇不同提取時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)。其結(jié)果如圖6所示，提取時(shí)間達(dá)到20 min后牛蒡苷基本提取完全，牛蒡苷元在30 min左右提取完全。由于超聲波具有較強(qiáng)的熱效應(yīng)，提取時(shí)間越長(zhǎng)，體系溫度就越不穩(wěn)定，并且可能會(huì)導(dǎo)致一些熱敏性物質(zhì)的破壞，同時(shí)能耗等經(jīng)濟(jì)成本也會(huì)增大。所以提取時(shí)間以20 min為宜。見(jiàn)圖6。

圖6 提取時(shí)間對(duì)牛蒡苷和牛蒡苷元提取率的影響

2.4.6 超聲功率的影響

見(jiàn)圖7。以10～120目混合粒徑的牛蒡子藥材為原料，以50%乙醇為溶劑，占空比為2∶3，液固比為10 mL/g，提取溫度50℃，提取時(shí)間為20 min的條件下，選擇不同超聲功率進(jìn)行試驗(yàn)。其結(jié)果如圖7所示，牛蒡苷和牛蒡苷元的提取率隨超聲功率的增大而增大。這是由于超聲波功率增大，其空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)以及熱效應(yīng)等均隨之增大，促進(jìn)了有效物質(zhì)的溶出。但提取率隨超聲波功率的增大而提高的程度并不十分明顯，且過(guò)高的超聲功率也不利于儀器的保護(hù)和節(jié)能。在本實(shí)驗(yàn)條件下，超聲功率以600 W為宜。

圖7 超聲功率對(duì)牛蒡苷和牛蒡苷元提取率的影響

2.5 正交設(shè)計(jì)

在前期單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲波提取牛蒡苷及牛蒡苷元的工藝。以50%乙醇為溶劑，占空比為2∶3，選取提取時(shí)間，提取溫度，超聲功率，液固比，藥材粒徑作為考察因素，進(jìn)行五因素四水平正交試驗(yàn)。因素水平表如表2所示。

表2 因素水平表

按照L16（45）試驗(yàn)安排分別進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，極差分析如表4所示。

表3 L16（45）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4極差分析表

將實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，極差分析，方差分析結(jié)果如表5所示。

表5 方差分析表

從分析結(jié)果可以看出，各因素對(duì)牛蒡苷和牛蒡苷元提取率的影響程度分別依次為B＞E＞A＞C＞D和B＞E＞C＞A＞D，即藥材粒徑對(duì)牛蒡苷和牛蒡苷元的提取均有十分顯著的影響，提取溫度的影響較小，提取時(shí)間，液固比以及超聲功率的影響都不顯著。牛蒡苷和牛蒡苷元提取的最佳因素水平組合分別為A1B4C3D1E3和A1B4C3D3E3。由于超聲功率的影響很小，出于對(duì)儀器的保護(hù)和節(jié)約能量的考慮，綜合考慮兩個(gè)物質(zhì)的提取條件，選取400 W為最適合功率。所以得到最優(yōu)提取條件如下:提取時(shí)間10 min，提取溫度50℃，液固比為14 mL/g，藥材粒徑為80～100目，超聲功率為400 W。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)上述最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到牛蒡苷的提取率為9.24%，牛蒡苷元的提取率是2.03%。均為試驗(yàn)范圍內(nèi)的最高值，說(shuō)明正交試驗(yàn)結(jié)果是可信的。

根據(jù)王曉琳［3］等所得的回流提取最優(yōu)條件:70%乙醇，10倍溶劑量，回流60 min，提取三次，牛蒡苷提取率為5.24%，牛蒡苷元提取率為1.09%。由此可見(jiàn)超聲提取率遠(yuǎn)高于回流提取。

3 討論

超聲波提取法作為一種天然產(chǎn)物活性成分分離提取的新技術(shù)、新方法，具有方便，高效的特點(diǎn)和較高的實(shí)用價(jià)值，值得認(rèn)真探索研究。本文通過(guò)試驗(yàn)，分別考察了提取溫度，液固比，超聲波功率，提取時(shí)間，占空比以及藥材粒徑對(duì)牛蒡苷及牛蒡苷元提取率的影響。并在此基礎(chǔ)上通過(guò)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化了提取工藝，得到最優(yōu)提取條件為:藥材粒徑80～100目，提取溫度50℃，液固比14 mL/g，超聲功率400 W，提取時(shí)間10 min。利用此最優(yōu)條件得到牛蒡苷提取率為9.24%，牛蒡苷元提取率為2.03%，均高于熱回流提取率。

［1］王 勁，侯鳳飛，康廷國(guó)，等.牛蒡苷的制備與純化［J］.中草藥，2002，33（9）:783.

［2］鞠玫君，竇德強(qiáng)，康廷國(guó).牛蒡子提取物中牛蒡苷和牛蒡苷元的含量測(cè)定研究［J］.中國(guó)現(xiàn)代中藥，2008，10（2）:14－16.

［3］王小琳，張玉杰，石任兵.正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選牛蒡子的提取工藝［J］. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26（4）:64－65.

［4］董文洪，劉 本.超臨界流體萃取牛蒡子中牛蒡子苷的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 中國(guó)中藥雜志，2006，31（15）:1240－1241.