李 慧， 曹文富*， 湯為學(xué)， 陳 平

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶 400016;2.重慶醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，重慶 400016）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，是造成終末期腎衰的主要病因。解聚復(fù)腎寧（JJFSN）是治療DN臨床療效較好的經(jīng)驗(yàn)方。我們以往的實(shí)驗(yàn)研究表明，該方對DN大鼠腎臟具有明顯的保護(hù)作用［1，2］。為進(jìn)一步研究 JJFSN治療 DN的作用機(jī)制，本文探討JJFSN對高糖環(huán)境下系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)分泌的影響。

1 材料

1.1 藥物 JJFSN由黃芪、生地、黃連、丹參、姜黃、葛根等13味中藥組成，全部中藥材均購自重慶桐君閣藥房，并經(jīng)專家鑒定符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。1.2 動物 7周齡SD大鼠，♀♂各半，體重180～220 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證 SCXK（渝）2007－0001。

1.3 細(xì)胞 大鼠腎小球系膜細(xì)胞株HBZY－1購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.4 試劑 胎牛血清（杭州四季青工程材料有限公司），MEM培養(yǎng)液（Hyclone公司），胰蛋白酶（GIBCO公司），四甲基偶氮噻唑藍(lán)（MTT）（Sigma公司），二甲基亞砜（DMSO）（Amresco公司），ColⅣ放射免疫試劑盒，Ln放射免疫試劑盒（均購自上海海研醫(yī)學(xué)生物有限公司）。

1.5 儀器 CO2培養(yǎng)箱（Kendro Laboratory Products）;倒置顯微鏡（Olympus，Japan）;酶標(biāo)儀（BIORAD，USA）;DFM－96型放射免疫γ計數(shù)器（合肥眾成機(jī)電技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司）等。

2 方法

2.1 解聚復(fù)腎寧（JJFSN）口服制劑的制備 精選黃芪、生地、黃連、葛根、丹參、姜黃等本制劑所用的全部中藥材，混合水提液并濃縮成JJFSN口服制劑（每mL含生藥2 g），4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 JJFSN含藥血清的制備 16只SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，即解聚復(fù)腎寧15、30、60 g/kg劑量組（各相當(dāng)于臨床成人日用藥量的5、10、20 倍）和純凈水處理組。參考文獻(xiàn)［3］，每日定時以解聚復(fù)腎寧制劑或純凈水灌胃1次，持續(xù)7 d。于末次灌胃后1 h，水合氯醛麻醉，頸動脈插管取血，4°C冰箱靜置，待少量淡黃色血清析出后，離心分離血清，56 °C，30 min 水浴滅活補(bǔ)體，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，分別制備成含解聚復(fù)腎寧血清（簡稱含藥血清）和正常血清，－20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 MTT比色法測MC增殖 選取對數(shù)生長期的MC細(xì)胞液，制備成濃度為1.5×104/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL。24 h細(xì)胞貼壁后，吸去上清，PBS清洗3次，分為以下實(shí)驗(yàn)組:1.正常組（NG組）:含10%正常大鼠血清的MEM培養(yǎng)液;2.高糖對照組（HG組）:葡萄糖25 mmol/L+含10%正常大鼠血清的MEM培養(yǎng)液;3.JJFSN低劑量組（LJ組）:葡萄糖25 mmol/L+含10%低劑量JJFSN大鼠血清的MEM培養(yǎng)液;4.JJFSN中劑量組（MJ組）:葡萄糖25 mmol/L+含10%中劑量JJFSN大鼠血清的MEM培養(yǎng)液;5.JJFSN高劑量組（HJ組）:葡萄糖25 mmol/L+含10%高劑量JJFSN大鼠血清的MEM培養(yǎng)液。每組設(shè)4個平行孔，置于37℃、5%CO2孵育箱中分別培養(yǎng) 12、24、48 h 后離心吸去上清液，每孔5 mg/mL MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心吸去上清，每孔加 DMSO 150 μL，自動酶標(biāo)比色儀570 nm波長處檢測各孔吸光度值（A）。2.4 RIA檢測培養(yǎng)上清中ColⅣ、Ln含量 細(xì)胞處理同上，將MC細(xì)胞按每孔104接種于96孔培養(yǎng)板中，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞上清，按照RIA試劑盒說明書進(jìn)行ColⅣ和Ln含量的測定。上清液ColⅣ和Ln數(shù)據(jù)處理擬合方式采用logit－log方程進(jìn)行，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出相應(yīng)的蛋白含量。每組各設(shè)3個復(fù)孔，取各組平均值作為最終結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均用±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度JJFSN含藥血清對MC增殖的影響

見表1。表1顯示:與NG對照組比較，高糖對大鼠腎小球MC的增殖具有顯著的促進(jìn)作用（P＜0.05），不同濃度JJFSN含藥血清作用于MC 12、24、48 h，均能顯著抑制MC增殖（P＜0.05），并且該抑制效應(yīng)隨JJFSN含藥血清濃度增加和作用時間的延長而增強(qiáng)。在JJFSN高劑量組作用48 h后，細(xì)胞增殖低于同一時間NG組（P＜0.05）。

表1 不同濃度JJFSN作用12 h、24 h及48 hMC增殖比較（A值，x ± s，n=4）

3.2 JJFSN對MC細(xì)胞外基質(zhì)分泌的影響

見表2。RIA結(jié)果顯示，高糖可以促進(jìn)MC ColⅣ和Ln分泌（P＜0.05）。JJFSN含藥血清作用48 h后，MC培養(yǎng)上清中ColⅣ和Ln含量明顯減低（P＜0.05），并且這種作用隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)。

表2 不同濃度JJFSN含藥血清作用48 h對ColⅣ以及Ln分泌的影響（ng/mL，±s）

表2 不同濃度JJFSN含藥血清作用48 h對ColⅣ以及Ln分泌的影響（ng/mL，±s）

與NG組比較，*P＜0.05;與HG組比較，#P＜0.05。

組 別NG組 HG組 LJ組 MJ組 HJ組ColⅣ 42.38±1.64 70.63±4.39* 56.36±2.78# 49.33±2.69# 41.39±2.05#Ln 51.80±4.33 80.29±3.95* 64.56±4.09# 55.61±3.53# 50.42±4.73#

4 討論

DN是糖尿病最主要的并發(fā)癥之一，是終末期腎衰的主要原因［4］。高糖為DN病情進(jìn)展的一個主要危險因素，既往研究認(rèn)為，高糖作用早期（48 h內(nèi)），可以促進(jìn)MC增殖，作用后期（48 h后）則可導(dǎo)致MC凋亡［5］。本實(shí)驗(yàn)將25 mmol/L高糖作用于MC，并于12、24、48 h觀察JJFSN含藥血清對MC增殖的影響。結(jié)果表明:經(jīng)高糖刺激后，MC增殖活性明顯增強(qiáng)，與文獻(xiàn)報道一致。此外，不同濃度JJFSN含藥血清均能抑制高糖誘導(dǎo)的MC增殖，且作用具有時間、劑量依賴關(guān)系。JJFSN高劑量組作用48 h后，細(xì)胞增殖明顯低于同一時間NG組。

除了影響MC增殖外，高糖還可以導(dǎo)致血液流變學(xué)改變，血管通透性增加，以及ECM的增多與沉積［6，7］。本研究著重觀察了JJFSN作用48h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中ColⅣ和Ln含量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:JJFSN可逆轉(zhuǎn)高糖對MC ColⅣ 和Ln分泌的促進(jìn)作用，顯著降低MC培養(yǎng)上清中ColⅣ和Ln的含量。

DN臨床辨證，以氣陰兩虛、瘀毒痰凝證型最為常見。解聚復(fù)腎寧是治療DN的有效經(jīng)驗(yàn)方，具有益氣養(yǎng)陰、解毒活血等作用。方中以黃芪益氣，生地養(yǎng)陰，黃連清熱解毒，葛根、姜黃活血通絡(luò)。臨床研究表明，黃芪可通過減少24h蛋白尿，尿白蛋白，以及改善餐后血糖和脂質(zhì)代謝，緩解DN病情［8］。亦有體外實(shí)驗(yàn)說明其提取物對MC增殖具有良性雙向調(diào)節(jié)作用［9］。黃連可降低早期糖尿病腎病大鼠腎組織VEGF蛋白和mRNA的表達(dá)［10］。方中其他藥物的單方或復(fù)方，在體內(nèi)及體外研究中亦有類似作用［11，12］。

本研究第一次觀察到了JJFSN對高糖引起的系膜細(xì)胞增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)分泌的抑制作用，為JJFSN用于臨床治療DN，防治早期腎小球硬化提供了新的依據(jù)。

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