劉 洪， 潘蘇華， 劉成鼎， 韋 敏， 許惠琴*

（1.南京中醫(yī)藥大學圖書館，江蘇南京 210046;2.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇南京 210046）

血栓形成和血栓栓塞性疾病與血小板活化因子PAF直接相關，它是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的血小板聚集誘導劑［1］。研究表明銀杏內酯B（GB）是血小板活化因子特異性受體拮抗劑［2］，然而GB水溶性極小，臨床使用受限。為使GB在治療血栓性疾病方面有更廣泛的應用，我們在GB母核上增加新的基團合成衍生物甲磺酸胺銀杏內酯B，增加了水溶性，見結構式圖。本試驗旨在考察甲磺酸胺銀杏內酯B對血小板聚集和釋放反應的影響，探討其治療血栓性疾病的特點及作用機制。

分子式:C24H33O10N·CH4O3S甲磺酸胺銀杏內酯B（dimethylaminoethyl ginkgolide B mesylate）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與主要試劑 甲磺酸胺銀杏內酯B，白色結晶（純度＞98%，分子量為591.63 g/moL），由南京柯菲平醫(yī)藥科技有限責任公司提供，用生理鹽水配制。銀杏內酯B（GB），白色結晶（分子量為424.4 g/moL），購自合肥標品生物技術有限公司，用二甲基亞砜配制。曲克蘆丁注射液:天津藥業(yè)焦作有限公司。血小板活化因子（PAF）:SIGMA公司。鈣離子指示劑Fluo－3－AM:Ivitrogen公司。TXB2放免試劑盒，6－keto－PGF1α放免試劑盒，購自北京華英生物技術研究所。其余試劑均為國產AR級。

1.1.2 動物 ♂性新西蘭家兔，由南京江寧縣湯山青龍山動物繁殖場提供，實驗動物生產許可證:SCXK（蘇）2002－0027。

1.1.3 儀器 FA－2104上皿電子天平（上海精科天平）。LDZ5－2離心機（北京醫(yī)用離心機廠）。XSP－13型光學顯微鏡（南京江南光學儀器廠）。PAPERI型血小板聚集及血凝測定儀（北京世帝科學儀器公司）。ZT－Ⅲ多頭細胞樣品收集器（上海躍進醫(yī)療器械廠）。SpectraMax? Gemini XS微孔板熒光檢測儀（Molecular Devices公司）。DFM－96型16管放射免疫γ計數器（合肥眾成機電技術開發(fā)有限責任公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 甲磺酸胺銀杏內酯B對PAF誘導家兔血小板聚集的影響

取♂性家兔48只，體重2.0～2.5 kg，隨機分為6組:①對照組:0.9%氯化鈉注射液。②曲克蘆丁組:24 mg/kg。③GB組:3.90 mg/kg。④甲磺酸胺銀杏內酯BⅠ組:1.95 mg/kg。⑤甲磺酸胺銀杏內酯BⅡ組:3.90 mg/kg。⑥甲磺酸胺銀杏內酯BⅢ:7.80 mg/kg。耳緣靜脈連續(xù)給藥5 d，給藥容積均為0.5 mL/kg。末次給藥15 min后頸總動脈取血，用3.8%檸檬酸鈉抗凝，血液與檸檬酸鈉容積之比為9∶1。800 r/min離心10 min后吸取上層血漿即得PRP。將剩余血液2 500 r/min離心10 min后吸取上層血漿即得貧血小板血漿（PPP）［3，4］。對 PRP 進行計數，若血小板濃度較高，則用PPP稀釋至360×109/L。先用250 μL PPP 進行定標，然后取 250 μL PRP加入測試杯中，在37℃預溫槽中預熱1 min后放入測試孔，按“開始”鍵時立即加入誘導劑0.01 mg/mL PAF 10 μL，測定最大聚集率，每只家兔同時測定4個測試孔取均值［5］。用公式計算血小板聚集抑制率［6］。

1.2.2 甲磺酸胺銀杏內酯B對PAF誘導家兔血小板釋放產物的影響

各組末次給藥后15 min取血，制備 PRP和PPP，進行血小板計數。

1.2.2.1 甲磺酸胺銀杏內酯B對PAF誘導家兔血小板釋放Ca2+的影響

（1）Flou－3－AM 導入血小板:在 4 mL PRP 中加入 4 μL Flou－3－AM（Flou－3－AM 用 DMSO 溶液配成 1 mg/mL）置37℃ 30 min，用Hepes緩沖液洗滌二次（800 r/min離心10 min，加入等體積Hepes緩沖液進行沖洗），混懸血小板（濃度大約為150×109/L）在Hepes緩沖液中待測。

（2）熒光測量:取上述負載Flou－3血小板懸液在熒光分光光度計上測定光強度（激發(fā)波長為505 nm，發(fā)射波長530 nm），計算血小板［Ca2+］i。

1.2.2.2 甲磺酸胺銀杏內酯B對PAF誘導家兔血小板中TXA2和PGI2含量的影響

放射免疫法（RIA）測定PAF誘導家兔血小板中TXA2和PGI2含量。由于TXA2和PGI2在37℃下性質不穩(wěn)定，很快水解為穩(wěn)定的代謝產物TXB2和 6－keto－PGF1α，因此可測定 TXB2和 6－keto－PGF1α的含量來反映TXA2和PGI2的水平。取血小板數為360 ×109/L PRP 500 μL，加 20 μL 0.01 mg/mL PAF 反應5 min 后，立即加入20 μL 10 μmol/L 消炎痛終止反應。然后離心（1 200 r/min，5 min），取上清400 μL于－20℃保存，按RIA試劑盒說明書測定 TXB2和 6－keto－PGF1α含量。

2 結果

2.1 甲磺酸胺銀杏內酯B對PAF誘導家兔血小板聚集的影響

甲磺酸胺銀杏內酯B 1.95、3.90、7.80 mg/kg 3個劑量組、GB3.90 mg/kg組和曲克蘆丁24 mg/kg組對PAF誘導的家兔血小板聚集率有抑制作用，與空白對照組比較有顯著性差異（P＜0.01）。見表1。

表1 甲磺酸胺銀杏內酯B對PAF誘導家兔血小板聚集的影響（x ± s，n=8）Tab.1 Influence of dimethylaminoethyl ginkgolide B mesylate on PAF-induced platelet aggregation in rabbit（x ± s，n=8）

2.2 甲磺酸胺銀杏內酯B對PAF誘導家兔血小板釋放產物的影響

2.2.1 甲磺酸胺銀杏內酯B對PAF誘導家兔血小板釋放Ca2+的影響

甲磺酸胺銀杏內酯B1.95、3.90、7.80 mg/kg 3個劑量組對PAF誘導家兔血小板釋放Ca2+均有抑制作用，在激發(fā)后10 min內與空白對照組比較有顯著性差異（P＜0.01）。曲克蘆?。?4 mg/kg）和GB（3.90 mg/kg）對PAF誘導家兔血小板釋放Ca2+有抑制作用，與空白對照組比較有顯著性差異（P＜0.01）。見表2。

2.2.2 甲磺酸胺銀杏內酯B對PAF誘導家兔血小板中 TXB2、6－keto－PGF1α含量的影響

甲磺酸胺銀杏內酯B1.95、3.90、7.80 mg/kg 3個劑量組對PAF誘導家兔血小板釋放TXB2有抑制作用，并可降低 TXB2/6－keto－PGF1α比值，其中甲磺酸胺銀杏內酯B7.80 mg/kg劑量組與空白對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。見表3。

表2 甲磺酸胺銀杏內酯B對PAF誘導家兔體外血小板釋放Ca2+的影響（x ± s，n=8）Tab.2 Influence of dimethylaminoethyl ginkgolide B mesylate on the release of Ca2+from PAF-induced platelet in rabbits（x ± s，n=8）

表3 甲磺酸胺銀杏內酯B對PAF誘導家兔血小板中TXB2、6-keto-PGF1α含量的影響（x ± s，n=8）Tab.3 Influence of dimethylaminoethyl ginkgolide B mesylate on the contents of TXB2and 6-keto-PGF1α from PAF-induced platelet in rabbits（x ± s，n=8）

3 討論

實驗結果表明，甲磺酸胺銀杏內酯B對PAF誘導的家兔血小板聚集有抑制作用，能減少血小板釋放 Ca2+、TXB2，降低 TXB2/6－keto－PGF1α比值。以上研究中，我們選取了曲克蘆丁和GB這兩個陽性對照藥。既住研究發(fā)現(xiàn)，曲克蘆丁體內給藥對PAF、ADP、AA、COL 有抑制作用［7］。曲克蘆丁系蘆丁經羥乙基化制成的半合成黃酮化合物，能夠增加紅細胞和血小板表面電荷密度，抑制紅細胞和血小板聚集，加強體內纖維蛋白溶解活性。而GB是甲磺酸胺銀杏內酯B的前體藥物，在血小板聚集和釋放反應中，甲磺酸胺銀杏內酯B與GB具有相似的藥理活性，均能抑制血小板聚集，抑制血小板釋放Ca2+、TXB2等活性物質。由于甲磺酸胺銀杏內酯B增加了水溶性，若作為新藥注射液開發(fā)具有一定的市場前景。

Ca2+是血小板代謝與功能的一個重要因子［8］，它參與血小板激活的許多重要環(huán)節(jié)，包括形狀變化、聚集和釋放。細胞內鈣離子濃度（［Ca2+］i）的平衡主要由細胞內鈣釋放和外鈣內流決定。細胞內鈣釋放的調節(jié)有兩個最經典的通道，三磷酸肌醇（IP3）信號調節(jié)通路和Ryanodine信號調節(jié)通路。本研究中，PAF激活膜磷脂酶C，催化磷脂酰肌醇水解，產生二脂酰甘油和三磷酸肌醇促使Ca2+由血小板內的致密管道系統(tǒng)釋放，并促使Ca2+內流導致血小板內游離Ca2+濃度升高進而觸發(fā)其聚集和釋放功能，使血液循環(huán)障礙進一步發(fā)展。甲磺酸胺銀杏內酯B可以抑制對PAF誘導的家兔血小板釋放Ca2+。由于GB是PAF受體特異性拮抗劑，因此推測，甲磺酸胺銀杏內酯B可能通過競爭性抑制PAF與PAF受體的結合，從而降低PAF誘導家兔血小板Ca2+的釋放。

TXA2是血小板活化的強誘導劑，也是一種致血管收縮和平滑肌細胞分裂的生物活性物質。主要由血小板合成，但也可以由單核細胞和血管平滑肌細胞（VSMCs）合成［9］。PGI2是 TXA2的內源性拮抗劑，具有抗血小板和血管的生物活性。主要由血管內皮細胞合成［10］。二者的平衡狀態(tài)關系到血管健康與否。甲磺酸胺銀杏內酯B可以抑制TXB2的釋放，降低 TXB2/6－keto－PGF1α比值。甲磺酸胺銀杏內酯B可能通過血小板內多重生物放大效應平臺，調節(jié)血小板內高度表達的COX－1和血栓素合成酶，從而抑制活化的血小板中TXA2合成。

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