王曉利， 王彩虹，2， 郭 懿， 王金林， 張俊松*

（1.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳518055；2.華南理工大學(xué)，廣東 廣州510006；3.復(fù)旦大學(xué)，上海 200433）

光誘導(dǎo)金絲桃素對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的毒作用和凋亡研究

王曉利1， 王彩虹1，2， 郭 懿3， 王金林1， 張俊松1*

（1.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳518055；2.華南理工大學(xué)，廣東 廣州510006；3.復(fù)旦大學(xué)，上海 200433）

金絲桃素；光動(dòng)力治療；發(fā)光二極管；鼻咽癌；凋亡

目的：探討以發(fā)光二極管為光源，金絲桃素光動(dòng)力療法對(duì)體外培養(yǎng)鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的毒作用和凋亡影響。方法：體外培養(yǎng)CNE-2細(xì)胞分別加入不同濃度的金絲桃素，另設(shè)血卟啉陽性對(duì)照組，避光培養(yǎng)6 h，分別用黃色和紅色發(fā)光二極管照射90 min，積累能量為5.67 J/cm2，培養(yǎng)24 h后用MTT法檢測(cè)金絲桃素和血卟啉在光照條件下對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的影響，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析和凋亡檢測(cè)。結(jié)果：MTT結(jié)果顯示光活化金絲桃素和血卟啉呈劑量依賴性抑制鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，IC50分別為0.049和0.650 μg/mL；流式細(xì)胞儀分析表明金絲桃素經(jīng)光照后，可使細(xì)胞停留在S期和G2期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，0.20 μg/mL金絲桃素作用18、28、48 h，凋亡率分別達(dá)到9.97%、72.19%、92.24%。結(jié)論：金絲桃素經(jīng)光誘導(dǎo)后，可有效抑制體外培養(yǎng)鼻咽癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡。

金絲桃素（Hypericin，HY）是貫葉金絲桃（Hypericum perforatum L.）中最具生物活性的物質(zhì)，屬萘并二蒽酮類，具有抗抑郁、抗病毒、抗腫瘤活性。光照條件下，金絲桃素能吸收光子，激發(fā)產(chǎn)生單線態(tài)氧，破壞細(xì)胞膜等，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，即具有光動(dòng)力活 性［1］。光 動(dòng) 力 療 法 （photodynamic therapy，PDT）是隨著光纖技術(shù)、激光醫(yī)學(xué)和內(nèi)鏡技術(shù)發(fā)展而興起的一種治療腫瘤的新方法，近二十年來，PDT開始進(jìn)入臨床試驗(yàn)，用于頭、頸、腦、肺、胰腺、腹腔、胸、前列腺和皮膚等腫瘤的治療，其中光敏劑和光源的選擇是光動(dòng)力治療中的關(guān)鍵和核心問題。早期的光敏劑大多是卟啉類衍生物（如血卟啉、光敏素），存在很多不足之處，比如對(duì)皮膚有長(zhǎng)時(shí)光毒性、對(duì)腫瘤組織選擇性低等［2］。金絲桃素具有與腫瘤親和性高及毒副作用較低等特點(diǎn)，是一種比較理想的光敏劑。鼻咽癌是東南亞及我國(guó)南方各省常見的一種惡性腫瘤，嚴(yán)重危害東南亞及我國(guó)南方人民的身心健康。本文以LED為光源，金絲桃素為光敏劑對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的毒作用及凋亡進(jìn)行了研究探討。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株

人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞株為南方醫(yī)科大學(xué)病理研究室惠贈(zèng)。

1.2 藥品與試劑

金絲桃素（Hypericin，HY）（美國(guó)Alexis公司）；RPMI1640培養(yǎng)基（美國(guó) Gibco公司）；胰蛋白酶-0.25%EDTA（美國(guó)Gibco公司）；新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，美國(guó)Sigma公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國(guó) Sigma公司）、血卟啉（Hematoporphyrin，HP）（美國(guó)Sigma公司）；Cycle TESTTMPLUS DNA Reagent Kit、Apo-BRDUTMKit（美國(guó) Becton Dickinson 公司）；其余試劑為分析純。

1.3 儀器

FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton Dickinson公司）；Spectramax M2光密度熒光檢測(cè)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）；LED光源（深圳佳進(jìn)光電技術(shù)有限公司）；二氧化碳孵箱（德國(guó)Binder公司）；倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；TQ8210型光纖功率計(jì)（日本愛德萬公司）；微孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

CNE-2細(xì)胞于37℃、5%CO2、相對(duì)飽和濕度條件下，在含10%小牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)，試驗(yàn)所選用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.5 腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率測(cè)定（MTT法）

調(diào)整細(xì)胞濃度為105個(gè)/mL，接種于96孔板，每孔加入100 μL，輕輕混勻，置二氧化碳孵箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞覆蓋率為70%左右。光照組和避光組，分別加入終濃度為 0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 μg/mL的金絲桃素，設(shè)只加溶劑DMSO的空白對(duì)照和血卟啉陽性對(duì)照組，陽性對(duì)照組加入終濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μg/mL 的血卟啉。避光培養(yǎng)6 h后，將黃光LED光源置于金絲桃素光照組正上方2 cm處，紅光LED光源置于陽性對(duì)照組正上方2 cm處，用光纖功率計(jì)調(diào)整光源功率密度為1.05 mW/cm2，照射90 min，積累能量約5.67 J/cm2后繼續(xù)培養(yǎng)20 h，吸去培養(yǎng)液，PBS（pH7.4）漂洗1次，加入100 μL終濃度為0.5 mg/mL的MTT無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h，小心吸去培養(yǎng)液，加入DMSO∶無水乙醇為1∶1的混和液100 μL溶解甲臜，振蕩15 min，用Spectramax M2光密度熒光檢測(cè)儀（波長(zhǎng)570 nm）測(cè)定各孔吸光值A(chǔ)570，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（Inhibition Rate，IR）% =（1－實(shí)驗(yàn)組A570平均值/對(duì)照組A570平均值）×100。Bliss方法［3］計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50。

1.6 細(xì)胞周期檢測(cè)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2于二氧化碳孵箱中培養(yǎng)24 h，分設(shè)0.20 μg/mL金絲桃素光照組、0.20 μg/mL金絲桃素不光照組和不加藥不光照三個(gè)組，避光培養(yǎng)6 h，將黃光LED光源置于培養(yǎng)孔正上方2 cm處，照射90 min，積累能量約5.67 J/cm2后繼續(xù)培養(yǎng)20 h，吸去培養(yǎng)液，PBS漂洗1次，胰酶消化，300 g離心5 min，PBS漂洗1次，離心后收集細(xì)胞，按Cycle TESTTMPLUS DNA Reagent Kit說明書處理細(xì)胞，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

分別收集0.20 μg/mL金絲桃素作用下培養(yǎng)18、28、48 h的加藥光照、加藥不光照組細(xì)胞，按Apo-BRDUTMKit說明書處理樣品，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各組間均數(shù)采用t檢驗(yàn)，結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 金絲桃素對(duì)CNE-2細(xì)胞的毒作用

光照條件下，不同濃度的金絲桃素對(duì)CNE-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率與空白對(duì)照組比較有極顯著差異（P<0.01）。當(dāng)金絲桃素的濃度為0.16 μg/mL時(shí)，對(duì)CNE-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率達(dá)到90%以上，再增加金絲桃素濃度，抑制率無明顯升高，結(jié)果見表1。避光條件下，單純給予金絲桃素，對(duì)CNE-2細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的抑制作用，結(jié)果見表2，但相同濃度下，光照組與避光組間存在極顯著差異（P<0.01），金絲桃素光照給藥組呈明顯的劑量依賴性，避光組的細(xì)胞抑制率明顯低于光照組，見圖1。光照條件下，金絲桃素對(duì)CNE-2細(xì)胞的 IC50為0.049 μg/mL，血卟啉對(duì)CNE-2細(xì)胞生長(zhǎng)也有明顯的抑制作用（P<0.01），見表 3，但其 IC50為 0.650 μg/mL，明顯高于金絲桃素。

表1 光照條件下金絲桃素對(duì)CNE-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用（±s，n=8）

表1 光照條件下金絲桃素對(duì)CNE-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用（±s，n=8）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01。

組別 HY濃度/（μg/mL） A570 0.932±0.029 0金絲桃素 0.04 0.536±0.021 42.5*0.08 0.286±0.023 69.4*0.12 0.146±0.010 84.4*0.16 0.089±0.011 90.4*0.20 0.062±0.012 93.3 IR/%對(duì)照*

表2 避光條件下金絲桃素對(duì)CNE-2的生長(zhǎng)抑制作用（ˉx ± s，n=10）

圖1 HY對(duì)CNE-2的生長(zhǎng)抑制作用

表3 光照條件下血卟啉對(duì)CNE-2的生長(zhǎng)抑制作用（ˉx ±s，n=6）

2.2 金絲桃素對(duì)細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果表明加藥光照組G1期細(xì)胞比率較加藥不光照組和不加藥不光照組明顯降低，S期和G2期的比率明顯升高。見表4和圖2。

表4 金絲桃素對(duì)CNE-2細(xì)胞周期的影響

2.3 金絲桃素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明，加藥不光照的細(xì)胞只出現(xiàn)少量凋亡細(xì)胞，隨著加藥孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡率逐漸增大，到48 h達(dá)到22.37%；而加藥光照組在28 h時(shí)凋亡率已可達(dá)72.19%，延長(zhǎng)至48 h可達(dá)92.24%，明顯高于非光照組，見表5和圖3。

圖2 金絲桃素對(duì)CNE-2細(xì)胞周期的影響圖

圖3 金絲桃素對(duì)CNE-2細(xì)胞凋亡的影響

表5 金絲桃素對(duì)CNE-2細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

MTT法是用于檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞毒作用的可靠方法之一，不僅可以發(fā)現(xiàn)有效的抗腫瘤藥物，還可以為細(xì)胞水平和分子水平的抗腫瘤作用機(jī)制研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)［4］。本文通過MTT法檢測(cè)觀察到光誘導(dǎo)金絲桃素呈劑量依賴性抑制體外培養(yǎng)CNE-2細(xì)胞的增殖。

血卟啉的主要副作用為光過敏，在體內(nèi)潴留長(zhǎng)達(dá)4周左右，此間患者須避免光照，較高濃度血卟啉可加重光過敏反應(yīng)。從上述試驗(yàn)結(jié)果可知，血卟啉的IC50值為0.650 μg/mL，是金絲桃素IC50值0.049 μg/mL的13倍多，金絲桃素用藥后避光時(shí)間短，藥物作用濃度低，副作用較血卟啉小，是一種較理想的光敏劑。

細(xì)胞周期中，S期是DNA合成期，G1和G2期為DNA合成前、后間期，無DNA的合成，但有RNA和蛋白質(zhì)的合成。當(dāng)DNA堿基受損時(shí)，細(xì)胞阻滯在G1期；當(dāng)DNA雙鏈斷裂時(shí)，細(xì)胞被阻滯在G2期。若在DNA復(fù)制不完全時(shí)，則M期激活因子活化抑制，在S期阻斷細(xì)胞周期［5］。大量研究表明：S期是化療藥物敏感時(shí)期，藥物可以通過影響DNA合成中所需的酶，或直接作用于DNA單鏈模板的活性部位，抑制DNA合成，將細(xì)胞阻滯于S期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)金絲桃素光照組處理的細(xì)胞與其他兩組對(duì)照比較，其S期和G2細(xì)胞比例明顯升高，作用機(jī)制可能與影響DNA的合成及復(fù)制有關(guān)。

隨著細(xì)胞凋亡分子機(jī)制研究不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路主要有兩條［6-7］：即細(xì)胞凋亡的線粒體依賴性途徑和死亡受體途徑。有研究表明線粒體不僅是新型光敏劑金絲桃素優(yōu)先定位的靶標(biāo)，也是光動(dòng)力損傷最先打擊的靶點(diǎn)［8］，它作用于細(xì)胞線粒體，使線粒體釋放細(xì)胞色素C，使細(xì)胞內(nèi)的DNA片段和細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生變化［9-10］。上世紀(jì)90年代初，國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)有些細(xì)胞的凋亡存在特異性，表現(xiàn)為不同因素誘導(dǎo)的凋亡發(fā)生在細(xì)胞周期的不同時(shí)相［11］。這類細(xì)胞凋亡，往往是細(xì)胞先被阻滯在細(xì)胞周期的某一時(shí)相，再發(fā)生細(xì)胞凋亡。本文通過流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果表明金絲桃素光照組的凋亡率隨時(shí)間延長(zhǎng)而明顯增大，給藥28 h達(dá)72.19%，48 h達(dá)92.24%，明顯高于金絲桃素非光照組，說明金絲桃素光照后，其對(duì)CNE-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用明顯增加。這與以往文獻(xiàn)報(bào)道金絲桃素?zé)o論在黑暗或光照條件下，都具有抑制腫瘤細(xì)胞生物活性作用相符［12］，只是單獨(dú)應(yīng)用時(shí)需要高劑量金絲桃素。許川山等［13］用石英鹵素?zé)糇鳛楣庠?，?90 nm波長(zhǎng)條件下進(jìn)行CNE-2細(xì)胞的凋亡研究，也得到凋亡率為53.08%的類似結(jié)果。

LED是近年來使用的一種新型光源，亮度高、功率小、壽命長(zhǎng)，可組裝成各種幾何形狀，有著普通光源不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。目前開發(fā)的LED光譜峰的半寬最窄已可達(dá)十幾納米以下，可供選擇的波長(zhǎng)范圍覆蓋整個(gè)可見光區(qū)，能滿足不同的波長(zhǎng)需求，其發(fā)光強(qiáng)度也完全可以滿足一般的臨床低強(qiáng)度治療需要。因此，無論在波長(zhǎng)、實(shí)用性和價(jià)格方面，LED都不遜色于激光器甚至更有優(yōu)勢(shì)［14］。國(guó)外已有人將LED光源應(yīng)用于腫瘤的PDT研究，如美國(guó)的研究人員用LED光源進(jìn)行腦腫瘤光動(dòng)力治療的臨床試驗(yàn)已取得了良好效果［15］，所用光源的機(jī)械性能比激光和其他光源更為可靠?？梢?，用LED光源代替激光器進(jìn)行生命科學(xué)研究具有廣闊的應(yīng)用前景。本文以金絲桃素為光敏劑，以LED作為PDT光源，試驗(yàn)結(jié)果表明光誘導(dǎo)金絲桃素對(duì)體外培養(yǎng)的鼻咽癌細(xì)胞CNE-2有明顯抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用，為鼻咽癌的體內(nèi)研究和臨床治療提供了理論依據(jù)。

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Photocytotoxic and apoptosis of hypericin-mediated on nasopharyngeal carcinoma cell line of human in vitro

WANG Xiao-li1， WANG Cai-hong1，2， GUO Yi3， WANG Jin-lin1， ZHANG Jun-song1*
（1.Shenzhen Polytechnic，Shenzhen 518055，China；2.South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；3.Fudan University，Shanghai 200433，China）

hypericin；photodynamic therapy；light emitting diode；nasopharyngeal carcinoma；apoptosis

AIM：To study effects of hypericin associated with light emitting diode irradiation on nasopharyngeal carcinoma cell line of human in vitro.METHODS：CNE-2 cells were exposed respectively to different concentra-tion of hypericin，and compared with hematoporphyrin as positive control group，and incubated for 6 h in the dark，then accumulative radiated energe of yellow and red light irradiation equivalent to 5.67 J/cm2were given throughout 90 min，killing effect and apoptosis of CNE-2 cells were detected by MTT assay after incubation of 24 h and flow cytometry.RESULTS：MTT assay showed that cytotoxicity of hypericin and hematoporphyrin with light irradiation presented in dose-dependent way，their IC50values were 0.049 and 0.650 μg/mL，respectively.Flow cytometry showed that hypericin with light irradiation could block cell growth at S phase and G2phase，when CNE-2 cells were exposed to hypericin at 0.20 μg/mL for 18，28 and 48 h，the apoptosis rate reached at 9.97%，72.19%and 92.24%.CONCLUSION：Hypericin with light irradiation could obviously inhibit the growth of CNE-2 cells and induce apoptosis.

R285.6

A

1001-1528（2010）08-1296-05

2009-11-13

深圳市科技和信息局科技基金項(xiàng)目（06KJP038）

王曉利（1964－），女，教授，從事抗腫瘤藥物及其機(jī)理研究。Tel：（0755）26019267

*通訊作者：張俊松，男，教授，Tel：（0755）26019366 E-mail：junsongzhang@yahoo.com.cn