季一兵， 范曉梅，2， 朱丹妮

（1.中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇南京210009；2.廣東華南新藥創(chuàng)制中心，廣東廣州 510663）

復(fù)方生脈散的毛細(xì)管電泳指紋圖譜研究

季一兵1， 范曉梅1，2， 朱丹妮1

（1.中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇南京210009；2.廣東華南新藥創(chuàng)制中心，廣東廣州 510663）

生脈散；毛細(xì)管電泳；指紋圖譜

目的：利用毛細(xì)管電泳（CE）方法建立中藥復(fù)方生脈散（紅參、麥冬、五味子）的指紋圖譜。方法：采用序貫式均勻設(shè)計(jì)的方法優(yōu)化CE分離條件，確定生脈散指紋圖譜的電泳條件為：以pH為9.5、44 mmol/L硼砂、34 mmol/L SDS為緩沖溶液體系，運(yùn)行電壓25 kV，溫度25℃，壓力進(jìn)樣50 mbar×100 s，檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm。結(jié)果：11批生脈散CE指紋圖譜中確認(rèn)了20個(gè)主要的共有指紋峰，其中4個(gè)峰來(lái)自紅參，6個(gè)峰來(lái)自麥冬，13個(gè)峰來(lái)自五味子，3個(gè)峰為紅參和麥冬共有，1個(gè)峰為麥冬和五味子共有，另外1個(gè)為新成分。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、可靠，可為生脈散的質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制提供科學(xué)依據(jù)。

R284.1

A

1001-1528（2010）08-1277-05

生脈散來(lái)源于《醫(yī)學(xué)啟源》，是已有820年歷史的著名古方。生脈散是由紅參、麥冬、五味子3味藥組成，具有益氣生津、養(yǎng)陰復(fù)脈的功效，現(xiàn)代臨床上被廣泛用于治療心血管疾病，療效顯著［1］。國(guó)內(nèi)外對(duì)生脈散的研究主要集中在藥理藥效［2-3］、臨床應(yīng)用［4-5］和化學(xué)成分［6-8］等方面，而對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制的研究較少。為了確保生脈散臨床用藥的有效性和安全性，非常有必要建立指紋圖譜來(lái)控制其質(zhì)量。

生脈散的成分較為復(fù)雜，而且民間常用水煎煮的方法來(lái)治療疾病，提取液中含有大量水溶性好的極性組分。毛細(xì)管電泳法以其柱效高、峰容量大、分析速度快、運(yùn)行費(fèi)用低、分析時(shí)間短、尤其適合極性大的組分分離分析的特點(diǎn)，在中藥分析特別是中藥復(fù)方分析中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。本試驗(yàn)采用毛細(xì)管電泳方法對(duì)中藥復(fù)方生脈散的指紋圖譜進(jìn)行研究，盡可能較為全面地反映其整體的化學(xué)成分，為生脈散的質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HP3DCE毛細(xì)管電泳儀（Agilent科技有限公司），二極管陣列檢測(cè)器，Chemstation工作站；未涂層石英毛細(xì)管柱（內(nèi)徑50 μm，有效長(zhǎng)度57 cm，河北永年光導(dǎo)纖維廠）；pHs-25型pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；電子分析天平（美國(guó)Sartorius公司）。

1.2 試藥

紅參、麥冬、五味子藥材為市售品，經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)中藥資源研究室秦民堅(jiān)教授鑒定，分別為五加科植物人參Panax ginseng C.A.Mey.的栽培品經(jīng)蒸制后的干燥根及根莖；百合科植物麥冬Ophiopogon japonicus（Thunb.）Ker-Gawl.的干燥塊根；木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)。五味子醇甲（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào) 110857-200709）、五味子乙素對(duì)照品（批號(hào) 110765-200609）。硼砂和SDS為分析純，甲醇為色譜純，純凈水（樂(lè)百氏）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取五味子醇甲、五味子乙素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL分別含五味子醇甲、五味子乙素1.0 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

按照紅參-麥冬-五味子=1∶3∶1.5的比例稱取藥材110 g，加水煎煮3次（各10倍，8倍，6倍量水），每次1 h，合并煎液，濾過(guò)，濾液減壓濃縮至濃度為1.1 g/mL生藥量的濃縮液。取0.5 mL濃縮液加水稀釋至10 mL，離心（3 000 r/min）5 min，上清液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液作為供試品溶液。紅參、麥冬、五味子溶液及各味藥材陰性對(duì)照溶液同法制備。

2.3 毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)條件

通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法優(yōu)化CE分離條件，確定的實(shí)驗(yàn)條件如下：以pH為9.5、44 mmol/L硼砂、34 mmol/L SDS為緩沖溶液體系，分離電壓25 kV，溫度25℃，壓力進(jìn)樣50 mbar×100 s，檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm。毛細(xì)管第一次使用前依次用1 mol/L NaOH、0.1 mol/L NaOH、去離子水沖30 min。每次實(shí)驗(yàn)前，用0.1 mol/L NaOH、去離子水各沖洗10 min，緩沖溶液沖5 min。兩次運(yùn)行之間用緩沖溶液沖洗3 min。

3 毛細(xì)管電泳條件的選擇和優(yōu)化

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用二極管陣列檢測(cè)器，結(jié)合生脈散中所含化學(xué)成分的光譜特征，考察了200、210、254、285 nm的譜圖特征。在200 nm波長(zhǎng)處出峰最多且峰強(qiáng)度大，一些有末端吸收的有效成分也可被檢測(cè)。

3.2 主要因素的篩選試驗(yàn)與結(jié)果

在預(yù)試驗(yàn)中，硼砂濃度、SDS濃度、緩沖溶液的pH值、甲醇比例、溫度、電壓影響生脈散組分的分離。然而不同實(shí)驗(yàn)因素對(duì)CE分離的影響程度存在差異，采用正交設(shè)計(jì)方法從上述六個(gè)因素中篩選出顯著影響分離的主要因素。選用L18（36）表安排實(shí)驗(yàn)，以所得電泳譜圖的峰數(shù)目作為衡量CE分離好壞的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)方差分析得出，硼砂濃度、SDS濃度兩個(gè)因素顯著影響譜圖的峰數(shù)目和分離效果。其余的因素則可固定在較優(yōu)的實(shí)驗(yàn)水平，緩沖溶液pH、溫度、電壓和甲醇比例分別為9.5、25℃、25 kV和0%。

3.3 序貫式均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)與結(jié)果

采用序貫式均勻設(shè)計(jì)對(duì)硼砂和SDS濃度作進(jìn)一步地優(yōu)化，選取U7（72）均勻設(shè)計(jì)表安排實(shí)驗(yàn)，每個(gè)因素考察7水平。根據(jù)最大峰數(shù)目來(lái)確定最優(yōu)分離條件，并以此實(shí)驗(yàn)條件為中心，縮小實(shí)驗(yàn)范圍和進(jìn)行新一輪的優(yōu)化試驗(yàn)；再以該輪實(shí)驗(yàn)中最優(yōu)條件為中心，繼續(xù)安排新一輪優(yōu)化試驗(yàn)，至獲得滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為止。本文通過(guò)三輪均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)（表1），得到了最佳的分離條件為44 mmol/L硼砂、34 mmol/L SDS，其他同上述條件。在該條件下所得譜圖峰的數(shù)目最多、分離佳且分析時(shí)間適宜。

表1 3輪均勻設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)范圍及結(jié)果

4 方法學(xué)考察

4.1 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，共有指紋峰的相對(duì)遷移時(shí)間RSD<1.6%，相對(duì)峰面積RSD<3.4%。

4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品6份，按2.2項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，在毛細(xì)管電泳儀上進(jìn)樣分析。共有峰的相對(duì)遷移時(shí)間RSD<2.7%，相對(duì)峰面積RSD<4.8%，表明該方法具有較好的重復(fù)性。

4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取新制備的供試品溶液于3 d內(nèi)每隔12 h測(cè)定一次，共有峰的相對(duì)遷移時(shí)間RSD<3.2%，相對(duì)峰面積RSD<4.8%。表明供試品溶液在3天內(nèi)基本穩(wěn)定。

5 指紋圖譜建立

5.1 樣品測(cè)定

按2.2項(xiàng)下方法分別制備11批供試品溶液，按2.3項(xiàng)下的電泳條件進(jìn)樣。樣品圖譜見(jiàn)圖1。

5.2 共有指紋峰的確認(rèn)及歸屬

通過(guò)比較生脈散與對(duì)照品的毛細(xì)管電泳圖譜中峰的在線紫外吸收光譜和遷移時(shí)間，確認(rèn)了五味子醇甲和五味子乙素。以五味子醇甲為參照物，計(jì)算11批生脈散電泳圖中各峰的相對(duì)遷移時(shí)間，通過(guò)對(duì)相對(duì)遷移時(shí)間與成分的紫外光譜比較，確定了20個(gè)分離較好或峰面積較大的主要共有峰（圖2）。各峰相對(duì)遷移時(shí)間、相對(duì)峰面積結(jié)果見(jiàn)表2、3。

圖1 11批生脈散CE指紋圖譜

圖2 生脈散CE指紋圖譜（20個(gè)主要共有峰，峰16-五味子醇甲，峰19-五味子乙素）

表2 生脈散共有峰的相對(duì)遷移時(shí)間

按2.3項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)條件建立單味藥材和各藥材陰性對(duì)照液的指紋圖譜。根據(jù)峰的在線紫外光譜和遷移時(shí)間，對(duì)11批生脈散指紋圖譜中主要共有峰的來(lái)源進(jìn)行歸屬。20個(gè)主要共有峰中有4個(gè)峰來(lái)自紅參（峰1、3、4、9），有6個(gè)峰來(lái)自麥冬（峰1、2、4、6、9、11），有 13 個(gè)峰來(lái)自五味子（峰 2、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20），5 號(hào)峰為復(fù)方煎煮過(guò)程中新產(chǎn)生的成分。其中3個(gè)峰為紅參和麥冬共有，1個(gè)峰為麥冬和五味子共有。

5.3 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

將所得的11批指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度計(jì)算軟件，進(jìn)行峰匹配并生成生脈散指紋圖譜的共有模式。以共有模式為標(biāo)準(zhǔn)，采用不同算法對(duì)每批樣品進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表4。在生成共有模式方法相同的條件下，夾角余弦法所得的相似度結(jié)果均略高于相關(guān)系數(shù)法的結(jié)果。相關(guān)系數(shù)方法主要反映兩矢量間的變化趨勢(shì)并可盡量減少背景截距的影響；而夾角余弦法則主要反映兩矢量間的夾角余弦值，表現(xiàn)了兩矢量間的形狀差異。兩種方法不存在本質(zhì)差異，都是矢量的內(nèi)積運(yùn)算。建立的11批生脈散指紋圖譜的相似度較高，表明藥材成分較穩(wěn)定，而且所采用的提取方法和優(yōu)化的電泳條件具有良好的穩(wěn)健性和可靠性。

6 討論

6.1 藥材提取方法的選擇

比較了水提和70%乙醇提兩種提取方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水提取的樣品溶液峰數(shù)多。臨床上生脈散以煎煮成湯藥的形式口服給藥治療疾病，為了更好地體現(xiàn)生脈散的藥效物質(zhì)成分，并保證與臨床應(yīng)用的一致性，本文選用水提取方法。

提取液經(jīng)濃縮、稀釋、離心、過(guò)濾后直接進(jìn)樣分析，不必經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑的處理等操作，能最大限度地保留生脈散中的活性成分。

6.2 毛細(xì)電泳方法及其模式的選擇

生脈散溶液采用反相高效液相色譜法分析時(shí)，即使梯度洗脫，分析時(shí)間長(zhǎng)約120 min，而且許多組分在色譜柱中無(wú)保留、難以分離。此外，提取液中含有色素、蛋白質(zhì)、糖類、鞣質(zhì)等干擾物，色譜柱極易被污染從而使壽命變短。CE法能克服以上缺點(diǎn)，得到理想的分離效果，并且成本低廉。毛細(xì)管電泳的緩沖體系為水溶液，不受有機(jī)溶劑的背景干擾，檢測(cè)波長(zhǎng)可低至190 nm。

表3 生脈散共有峰的相對(duì)峰面積

表4 不同算法的相似度計(jì)算結(jié)果

由于生脈散中有大量不帶電荷的中性分子，在CZE模式下分離效果差，于是選用MEKC模式進(jìn)行分離。硼砂電解質(zhì)可與含有多羥基和鄰位羥基的成分發(fā)生絡(luò)合作用，使不同組分的淌度差異拉大，分離度增加，提高了CE的選擇性。加入SDS可明顯改善后面出峰組分的分離度。

CE分析時(shí)影響因素很多，同時(shí)不同因素對(duì)分離的影響程度存在明顯的差異，而且生脈散成分眾多、極其復(fù)雜，可見(jiàn)建立科學(xué)可靠的指紋圖譜難度很大、工作量非常繁重。本文運(yùn)用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)一系列的實(shí)驗(yàn)因素同時(shí)進(jìn)行考察，確定顯著地影響分離的主要因素并優(yōu)化其實(shí)驗(yàn)水平，獲得最佳的分離條件。以盡量少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)達(dá)到最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，縮短方法建立的周期，達(dá)到事半功倍的效果。

本文方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好。在建立生脈散指紋圖譜的基礎(chǔ)上，可結(jié)合藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而研究指紋圖譜與藥效之間的相關(guān)性，更能為生脈散質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制提供依據(jù)。同時(shí)可構(gòu)建研究復(fù)方多組分在體內(nèi)吸收的血清指紋圖譜，闡明其入血成分、代謝產(chǎn)物及方劑配伍意義，從而揭示生脈散的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

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CE fingerprint of the compound Shengmai Powder

JI Yi-bing1， FAN Xiao-mei1，2， ZHU Dan-ni1
（1.China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China；2.The South China Center for Innovative Pharmaceuticals，Guangzhou 510663，China）

Shengmai Powder；capillary electrophoresis；fingerprint

AIM：To investigate the CE fingerprint of the compound Shengmai Powder（Radix et Rhizoma Ginseng rubra，Radix Ophiopogonis，F(xiàn)ructus Schisandrae chinensis）.METHODS：Sequential uniform design was used to optimize the separation conditions.A CE fingerprint for Shengmai Powder was established using buffer comprising 44 mmol/L borate and 34 mmol/L SDS at pH 9.5，a running voltage of 25 kV，a capillary temperature of 25 °C and a wavelength of 200 nm.The sample was injected at a pressure of 50 mbar for 100 s.RESULTS：From the fingerprints of eleven batches of sample solutions，twenty main common peaks were determined.four peaks came from Radix et Rhizoma Ginseng，six peaks from Radix Ophiopogonis，thirteen peaks from Fructus Schisandrae chinensis，three peaks shared by Radix et Rhizoma Ginseng and Radix Ophiopogonis，one peak shared by Radix Ophiopogonis and Fructus Schisandrae chinensis and one new constituent.CONCLUSION：The developed method is accurate and reliable，and the fingerprint analysis can be used for the quality assessment and control of compound Shengmai Powder.

2009-11-17

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30772792）

季一兵（1970－），女，副教授，理學(xué)博士，研究方向：中藥質(zhì)量控制及現(xiàn)代儀器分析。Tel：（025）86185150 E-mail：jiyibing@jlonline.com