蒲珂，李少一，馬麗，高蕓，劉云會(huì)

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽(yáng) 110004；2.上海交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)院，上海 200011；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌研究所，沈陽(yáng) 110001）

髓母細(xì)胞瘤（medulloblastoma，MB）是惡性程度極高的兒童后顱窩腫瘤，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，易播散轉(zhuǎn)移，手術(shù)難以完全切除，預(yù)后極差［1］。基因治療為顱內(nèi)惡性腫瘤的治愈帶來(lái)了希望，其中研究最廣泛、最有希望的是單純皰疹病毒腺苷激酶/更昔洛韋（herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir，HSV-tk/GCV）自殺基因系統(tǒng)。HSV-tk/GCV系統(tǒng)抗腫瘤作用的原理是在腫瘤細(xì)胞中導(dǎo)入腺苷激酶（thymidine kinase，TK）基因，TK基因表達(dá)的腺苷激酶可以將無(wú)毒的更昔洛韋（ganciclovir，GCV）在腫瘤局部轉(zhuǎn)化為有毒的三磷酸更昔洛韋，從而發(fā)揮高效的抗腫瘤作用。該自殺基因系統(tǒng)毒副作用小，抗腫瘤效果強(qiáng)，受到了廣泛關(guān)注。

TK基因介導(dǎo)的自殺基因治療中還存在一種機(jī)制——“旁觀(guān)者效應(yīng)”：當(dāng)給予更昔洛韋時(shí)，導(dǎo)入TK基因的“陽(yáng)性細(xì)胞”周邊的未導(dǎo)入TK基因的“陰性細(xì)胞”也會(huì)被一同殺死的現(xiàn)象。在“旁觀(guān)者效應(yīng)”存在的情況下，TK基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的殺傷作用進(jìn)一步增強(qiáng)。在我們以前的研究中，應(yīng)用HSV-tk/GCV自殺基因系統(tǒng)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，并且應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞攜帶TK基因，對(duì)該治療系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了很好的治療效果［2~5］。而在好發(fā)于兒童的髓母細(xì)胞瘤中應(yīng)用HSV-tk/GCV自殺基因系統(tǒng)的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究聯(lián)合應(yīng)用全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）與 HSV-tk/GCV 系統(tǒng)，研究二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系Daoy的殺傷作用，旨在探討在髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中應(yīng)用HSV-tk/GCV自殺基因治療可行性，并且針對(duì)ATRA對(duì)該系統(tǒng)中“旁觀(guān)者效應(yīng)”的影響進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及細(xì)胞株

ATRA、噻唑藍(lán)（MTT）、G418、二甲基亞楓（DMSO）均購(gòu)自Sigma公司，Polybrene購(gòu)自Aldrich公司。Daoy髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。產(chǎn)生復(fù)制缺陷型HSVtk逆轉(zhuǎn)錄病毒的PA317包裝細(xì)胞由Genetic Therapy公司提供。

1.2 ATRA對(duì)Daoy細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Daoy細(xì)胞，以2×103/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后加不同濃度的ATRA（0~1 μmol/L），每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每天換液1次，3 d后MTT法測(cè)細(xì)胞存活率。

1.3 Daoy細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及篩選

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Daoy細(xì)胞，以50%~60%細(xì)胞密度鋪于6孔板，4~6 h后更換為加入1 ml HSV-tk逆轉(zhuǎn)錄病毒上清和8μg/ml的Polybrene的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換為正常培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24孔板，加200μg/ml G418篩選，每3 d換液1次，篩選12 h，選取有G418抗性的細(xì)胞在以后的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用。

1.4 Daoy-tk細(xì)胞對(duì)GCV敏感性測(cè)定

對(duì)照組：正常Daoy細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組：Daoy-tk細(xì)胞。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩種細(xì)胞以2×103/孔密度接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后，加不同濃度梯度的GCV（0~30μg/ml），每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，條件培養(yǎng)液每2 d更換1次。第7天MTT法測(cè)細(xì)胞生存率：每孔加入5μg/ml的MTT 20μl，37℃孵育4 h，棄培養(yǎng)液，加入DMSO 150μl，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上以492 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光光度值（A）。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A均值/對(duì)照組A均值×100%。

1.5 在不同濃度GCV存在下，Daoy-tk細(xì)胞通過(guò)“旁觀(guān)者效應(yīng)”對(duì)Daoy細(xì)胞的殺傷作用

對(duì)照組：?jiǎn)为?dú)Daoy細(xì)胞；治療組：Daoy-tk與Daoy 1∶1比例混合，以4×103/孔的細(xì)胞密度接種于96 孔板，加不同濃度的 GCV（0~30 μg/ml），每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，條件培養(yǎng)液2 d更換1次。7 d后MTT法測(cè)細(xì)胞生存率。

1.6 Daoy-tk聯(lián)合ATRA對(duì)Daoy細(xì)胞殺傷作用的觀(guān)察

（1）對(duì)照組：?jiǎn)为?dú) Daoy細(xì)胞；（2）Daoy-tk單獨(dú)治療組：Daoy-tk與Daoy細(xì)胞按不同比例（1∶1~1∶16）混合；（3）Daoy-tk 與 ATRA 聯(lián)合治療組：Daoy-tk與Daoy細(xì)胞按不同比例（1∶1~1∶16）混合。以上3組均以4×103/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板，每種細(xì)胞比例設(shè)3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組和Daoy-tk單獨(dú)治療組加3μg/ml GCV，Daoy-tk與ATRA聯(lián)合治療組加3 μg/ml GCV和1μmol/L的ATRA。2 d換液1次，7 d后MTT法測(cè)細(xì)胞生存率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)，以x±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ATRA對(duì)Daoy細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

不同濃度的ATRA對(duì)Daoy細(xì)胞作用3 d后，MTT結(jié)果表明：在0.5~1μmol/L區(qū)間范圍內(nèi)，ATRA即可對(duì)Daoy細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯抑制作用，并且隨ATRA濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)ATRA濃度為0.5μmol/L時(shí)，Daoy細(xì)胞的存活率約為90.13%；ATRA濃度為1μmol/L時(shí)，Daoy細(xì)胞的存活率為79.13%，與ATRA濃度為0μmol/L時(shí)的對(duì)照組相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 Daoy-tk對(duì)GCV的敏感性

Daoy細(xì)胞與轉(zhuǎn)染后的Daoy-tk細(xì)胞分別加入不同濃度的GCV，7 d后MTT結(jié)果顯示：Daoy-tk細(xì)胞在GCV濃度為0.1μg/ml時(shí)出現(xiàn)大量死亡，3μg/ml時(shí)達(dá)到最大殺傷作用，而未轉(zhuǎn)染的Daoy細(xì)胞在GCV濃度為30μg/ml時(shí)才出現(xiàn)明顯死亡，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 在不同濃度GCV存在下，Daoy-tk細(xì)胞通過(guò)“旁觀(guān)者效應(yīng)”對(duì)Daoy細(xì)胞殺傷作用

為了觀(guān)察不同濃度GCV作用下，Daoy-tk細(xì)胞通過(guò)“旁觀(guān)者效應(yīng)”對(duì)Daoy細(xì)胞的殺傷作用及確定GCV的最低有效劑量，在Daoy與Daoy-tk混合細(xì)胞中加入不同濃度的GCV，7 d后MTT結(jié)果顯示：GCV在3μg/ml濃度時(shí)即對(duì)Daoy產(chǎn)生最大殺傷作用，此時(shí)Daoy細(xì)胞的存活率為57.69%。繼續(xù)加大GCV濃度，不能增強(qiáng)其抗腫瘤效果。見(jiàn)圖3。

2.4 聯(lián)合應(yīng)用ATRA與Daoy-tk對(duì)Daoy細(xì)胞殺傷作用

Daoy-tk與Daoy細(xì)胞按不同比例混合，加入3 μg/ml的GCV后，對(duì)Daoy細(xì)胞產(chǎn)生明顯的殺傷作用，并且隨Daoy-tk細(xì)胞比例的增加，殺傷作用逐漸增強(qiáng)，Daoy-tk∶Daoy=1∶4時(shí)，Daoy細(xì)胞存活率為89.23%；聯(lián)合應(yīng)用1μmol/l的ATRA后，明顯增強(qiáng)對(duì)Daoy細(xì)胞的殺傷作用，Daoy-tk∶Daoy=1∶16時(shí)，仍有明顯的殺傷作用，Daoy細(xì)胞存活率為89.7%。見(jiàn)圖4。

3 討論

自殺基因療法是基因治療中研究最廣泛、最有希望的治療方法，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系均具有很強(qiáng)的殺傷作用。但臨床實(shí)驗(yàn)中抗腫瘤效果并不讓人滿(mǎn)意［6］，除了病毒載體的轉(zhuǎn)染效率低之外，“旁觀(guān)者效應(yīng)”作用低下也是重要原因?！芭杂^(guān)者效應(yīng)”的發(fā)揮依賴(lài)于細(xì)胞間縫隙連接通訊（gap junctional intercellular communicatisn，GJIC）的建立，惡性腫瘤細(xì)胞具有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)、易播散轉(zhuǎn)移的特性，GJIC的建立相對(duì)較少［7］。如何增強(qiáng)“旁觀(guān)者效應(yīng)”，成為目前自殺基因治療需要攻克的重要課題。在我們以前的研究中，應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞攜帶TK基因，利用神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的主動(dòng)運(yùn)動(dòng)的趨化能力，將TK基因盡可能攜帶到腫瘤細(xì)胞周?chē)?，產(chǎn)生更大的“旁觀(guān)者效應(yīng)”，獲得了非常好的治療效果［4］，但針對(duì)“旁觀(guān)者效應(yīng)”機(jī)制方面加強(qiáng)TK基因抗腫瘤效果的研究報(bào)道很少，這方面的工作必將為HSV-tk/GCV自殺基因治療系統(tǒng)取得更好的臨床療效提供有益補(bǔ)充。

ATRA是維生素A的重要衍生物，臨床已廣泛應(yīng)用于血液系統(tǒng)腫瘤的治療，其自身即可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化與凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)ATRA在極低濃度下（0.5~1μmol/L）即可對(duì)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系Daoy的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯抑制作用。而有報(bào)道ATRA在1~10 μmol/L濃度范圍內(nèi)才可對(duì)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用［8］，可見(jiàn)Daoy細(xì)胞系對(duì)ATRA的敏感性更高。

ATRA除了自身對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用外，還可以上調(diào)腫瘤細(xì)胞間GJIC的表達(dá)。張雪峰等研究表明，ATRA能提高膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞系中Cx43的表達(dá)，ATRA提高Cx43表達(dá)后能進(jìn)一步增強(qiáng)HSV-tk/GCV系統(tǒng)對(duì)膠質(zhì)瘤的殺傷作用［9］。Chen 等［10］研究表明，聯(lián)合應(yīng)用ATRA能增強(qiáng)HSV-tk/GCV系統(tǒng)對(duì)前列腺癌細(xì)胞的殺傷作用。本實(shí)驗(yàn)中我們證實(shí)，tk細(xì)胞與Daoy細(xì)胞比例為1∶4時(shí)，對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。聯(lián)合應(yīng)用ATRA時(shí)即使tk細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞比例低至1∶16時(shí)仍有明顯的腫瘤抑制作用，并且同等細(xì)胞比例條件下，聯(lián)合治療組對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用更強(qiáng)。作為脂溶性藥物，ATRA可以自由通過(guò)血腦屏障在腦內(nèi)儲(chǔ)集，是聯(lián)合HSV-tk/GCV系統(tǒng)治療顱內(nèi)惡性腫瘤的理想用藥。

綜上所述，ATRA與HSV-tk/GCV系統(tǒng)聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)人的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系Daoy的殺傷具有協(xié)同作用。聯(lián)合應(yīng)用兩種臨床安全性都已得到證實(shí)的治療方案，必定使顱內(nèi)惡性腫瘤的治療具有廣闊的前景。

［1］Packer RG，Vezina G.Management of and prognosis with medulloblastoma：therapyatacrossroads［J］.Arch Neurol，2008，6（11）：1419-1424.

［2］Li S，Tokuyama T，Yamamoto J，et al.Potent bystander effect in suicide gene therapy using neural stem cells transduced with herpes si mplex virus thymidine kinase gene［J］.Oncology，2005，69（6）：503-508.

［3］Li S，Tokuyama T，Yamamoto J，et al.By stander effect-mediated gene therapy of gliomas using enetically engineered neural stem cells［J］.Cancer Gene Therapy，2005，12（7）：600-607.

［4］Li S，Gao Y，Tokuyama T，et al.Genetically engineered neural stem cells migrate and suppress glioma cell growth at distant intracranial sites［J］.Cancer Letters，2007，251（2）：220-227.

［5］李少一，高蕓，刁宏宇，等.應(yīng)用導(dǎo)入HSV-tk基因的神經(jīng)干細(xì)胞治療膠質(zhì)瘤的體外實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華神經(jīng)外科雜志，2006，22（12）：759-761.

［6］林松，王忠誠(chéng)，張懋植，等.胸苷激酶基因治療惡性膠質(zhì)瘤I期臨床研究［J］.中華神經(jīng)外科雜志，2004，20（05）：381-384.

［7］Huang RP，Hossain MZ，Sehgal A，et al.Reduced connexin43 expression in high-grade human brain glioma cells［J］.Surg Oncol，1999，70（1）：21-24.

［8］綦斌，譚巖，羅毅男，等.全反式維甲酸誘導(dǎo)大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)腫瘤臨床，2008，35（1）：44-48.

［9］張雪峰，任祖淵，方福德，等.全反式維甲酸與單純皰疹病毒胸苷激酶基因?qū)δz質(zhì)瘤的協(xié)同殺傷作用［J］.癌癥，2002，25（5），473-479.

［10］Chen W，Yan C，Hou J，et al.ATRA enhances bystander effect of suicidegenetherapyinthetreatmentofprostatecancer［J］.Urol Oncol，2008，26（4）：397-405.