王冬梅，宮德正，殷盛明，于德欽，徐 紅，徐 靜，趙 杰，孫藝平，△

(1.大連醫(yī)科大學(xué)機(jī)能學(xué)實驗室，遼寧 大連 116044;2.大連醫(yī)科大學(xué)生理教研室，遼寧 大連 116044)

核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)的激活可高效誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄，在炎癥和免疫反應(yīng)中起著調(diào)控作用。目前有關(guān)抑制NF-κB活化的“圈套”策略已在心臟再灌注損傷、腎小球性腎炎等炎癥性疾病的動物實驗中顯示療效[1]。本研究將利用具有神經(jīng)元細(xì)胞模型特點的PC12細(xì)胞，以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作為NF-κB的活化劑 ，觀察κB-decoy 對NF-κB的抑制作用 ，以建立NF-κB“圈套”對PC12細(xì)胞中NF-κB抑制的模型，為探討由NF-κB過度活化導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)某些疾病的基因防治措施提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 κB-decoy的設(shè)計與合成

根據(jù)NF-κB增強(qiáng)子的特定序列5'-GGGACTTTCC-3'，設(shè)計包含2個拷貝的NF-κB特異結(jié)合序列的啞鈴形圈套寡核苷酸和與其堿基數(shù)相同的隨機(jī)序列(大連寶生物公司)。

1.2 載體包裹寡核苷酸

按比例以每孔(6孔板)15μl LF2000(Invitrogen)溶于 375μl無血清的 Opti-MEM I Reduced Serum Medium(Invitrogen)中室溫充分混勻5 min;將DNA(6μg/well)溶于 375μl無血清的 Opti-MEM I Reduced Serum Medium中;將以上兩種溶液混合，室溫孵育20min。

1.3 PC12細(xì)胞處理

轉(zhuǎn)染前24h，將7.5×105個PC12細(xì)胞溶于2 ml生長培養(yǎng)基中，之后接種于6孔板中(用于免疫細(xì)胞化學(xué)染色實驗的需鋪蓋玻片)，最終使接種濃度達(dá)到90%;細(xì)胞24h貼壁后換液(正常1640無雙抗培養(yǎng)液，2 ml/well);將細(xì)胞分3組進(jìn)行處理，實驗組:LF2000+κB-decoy;對照組 :LF2000+錯配-decoy;正常組:LF2000;每孔加入1.2中的混合液750μl混勻;將6孔板放于37℃的CO2培養(yǎng)箱，細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后更換正常無雙抗培養(yǎng)液(2 ml/well)，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，稀釋LPS(200ng/ml)，作用0.5～4h。

用于Western blot方法檢測的細(xì)胞:吸去培養(yǎng)液，1×PBS洗2遍，1×Loading Buffer刮板收集細(xì)胞，加入 200μl 1 ×Loading Buffer/well，漩渦振蕩，煮樣10min，12000×g 4℃離心10min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用于免疫細(xì)胞化學(xué)染色實驗的細(xì)胞，將爬滿細(xì)胞的蓋玻片以0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次后，冷丙酮固定20min，-20℃保存。

1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

將爬滿細(xì)胞的蓋玻片以0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次，用1%H2O2作用10min，5%羊血清(含有0.3%triton-100的PBS)封閉20min，加一抗NF-κBp65(Santa Cruz)1∶100，在濕盒中 4 ℃過夜，0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次，再分別與二抗(1∶400)室溫孵育1 h，0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次，與卵白素-生物素復(fù)合物室溫孵育2 h，0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次，DAB顯色 5～10min，顯微鏡下觀察適時終止反應(yīng)，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。

1.5 Western blot分析

按照蛋白提取試劑盒說明書提取PC12細(xì)胞內(nèi)總蛋白采用 Bradfold法進(jìn)行蛋白定量，以 100μg蛋白質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)，算出所需原液體積，補(bǔ)加1×PBS使總體積為15μl，再向每個樣品管中加 5μl的 4×Loading Buffer混勻，蛋白于100g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜，加NF-κB p65抗體(1∶500)，4℃過夜，將PVDF膜在33℃條件下結(jié)合二抗(1∶3000)1 h，ECL顯色，照片采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行密度分析。

1.6 圖像分析

使用Nikon顯微攝影系統(tǒng)及NIS-Elements F2.30分析軟件對其免疫反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行平均光密度(Mean density)測定，以細(xì)胞為單位(n=30)，選擇圖像中棕黃色區(qū)域。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

使用Excel、SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩組間差異顯著性采用t檢驗(t-TEST)，多組間差異采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

正常組:基礎(chǔ)水平時，細(xì)胞胞漿無色或呈微棕色、胞核無棕色染色;經(jīng)LPS刺激4h后，胞漿呈淺棕色或棕色，胞核呈棕色或深棕色染色，NF-κB活化明顯(P＜0.01)。對照組(轉(zhuǎn)染錯配-decoy):基礎(chǔ)水平時NF-κB p65表達(dá)水平與正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞相似;以LPS刺激0.5～4h，隨著時間的延長，細(xì)胞中胞漿染色由淺棕色逐漸增加至深棕色、胞核由無或淺棕色逐漸增加至棕黃色，2 h時NF-κB p65的表達(dá)至最高水平，4h時有所下降;實驗組(轉(zhuǎn)染κB-decoy):基礎(chǔ)水平時胞漿與胞核均無棕黃色染色，以LPS刺激0.5～4h，隨著時間的延長，胞漿與胞核染色均逐漸增加至淺棕或微棕色，2 h時達(dá)最高水平，4h時有所下降;與相應(yīng)時間點的對照組相比，NF-κB p65的表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01)，2～4h最為明顯(圖1)。

2.2 Western blot分析

正常組與對照組的 PC12細(xì)胞中 NF-κB p65 Western blot分析的陽性信號較弱;實驗組與正常組和對照組相比明顯降低(P＜0.01);正常組細(xì)胞經(jīng)LPS刺激 4h 后，NF-κB p65 Western blot分析的陽性信號比基礎(chǔ)水平明顯增強(qiáng)(P＜0.01);對照組的PC12細(xì)胞經(jīng)LPS刺激4h后比基礎(chǔ)水平明顯增強(qiáng)(P＜0.01)，與正常組相似;實驗組的PC12細(xì)胞經(jīng)LPS刺激4h后比基礎(chǔ)水平明顯增強(qiáng)(P＜0.01)，與對照組相比明顯降低(P＜0.01，圖2)。

3 討論

NF-κB作為一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，是多種信號傳導(dǎo)途徑的匯聚點。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB過度活化與神經(jīng)系統(tǒng)某些疾病的炎癥反應(yīng)有著密切關(guān)系[2-4]，因此探討和研究抑制NF-κB的活化對神經(jīng)系統(tǒng)某些疾病的炎癥反應(yīng)，特別是對神經(jīng)退行性疾病中的腦保護(hù)作用具有一定意義。

Fig.1 Immunocytochemistry of NF-κB in PC12 cells(×100，×400)

Fig.2 Western blot analysis of NF-κB expression in PC12 cells A:Western blot;B:Relative optical density of the Western blot analysis

PC12細(xì)胞株最早是由Greene和Tischler從大鼠移植的嗜鉻細(xì)胞瘤(腎上腺)中獲得[5]，在神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)誘導(dǎo)下，PC12細(xì)胞能長出大量軸突、分化成交感神經(jīng)樣細(xì)胞，而且神經(jīng)樣分化的PC12細(xì)胞具有大多數(shù)神經(jīng)元的形態(tài)、生化和生理特性[6]，因其具有可傳代培養(yǎng)的特點，作為神經(jīng)元細(xì)胞模型，可用于神經(jīng)生理、病理及藥理方面的研究。近年來，PC12細(xì)胞作為神經(jīng)系統(tǒng)損傷的細(xì)胞模型，已被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)元的毒性損害的研究[7，8]。

拮抗 NF-κB的策略有多種，只有對NF-κB與DNA順式元件的結(jié)合實施直接干預(yù)措施，才能達(dá)到真正的特異性?！叭μ住辈呗詣t是合成與順式元件相一致的雙鏈寡聚脫氧核苷酸轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，競爭性抑制反式因子(轉(zhuǎn)錄因子)與順式元件的結(jié)合，干擾轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性及其后續(xù)基因的表達(dá)，所以“圈套”策略已成為拮抗NF-κB活性的最佳選擇之一。自1996年第一個經(jīng)美國藥品和食品管理局(FDA)批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)錄因子E2F“圈套/誘騙”策略用于治療血管旁路移植傷后新生內(nèi)膜增生患者以來，許多研究已報告了該策略作為體內(nèi)基因治療效果[1]。目前有關(guān)NF-κB“圈套”策略已應(yīng)用于與NF-κB過度活化相關(guān)疾病，如心臟再灌注損傷、腎小球性腎炎等炎癥性疾病的治療，其動物實驗已顯示出確切而顯著的療效[9，10]。

在本研究中，依據(jù)NF-κB增強(qiáng)子的特定序列5'-GGGACTTTCC-3'設(shè)計包含2個拷貝的NF-κB特異結(jié)合序列的啞鈴形圈套寡核苷酸轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞后，可明顯降低NF-κB的基礎(chǔ)表達(dá)水平，再以LPS刺激PC12細(xì)胞活化NF-κB，可明顯抑制NF-κB的活化;提示κB-decoy可以降低生理狀態(tài)下PC12細(xì)胞中NF-κB的正常表達(dá)水平，抑制病理狀態(tài)下PC12細(xì)胞中NF-κB的活化。此細(xì)胞模型的建立為我們深入探討NF-κB對下游基因表達(dá)調(diào)控奠定了基礎(chǔ)，也為抑制腦內(nèi)NF-κB活化基因療法提供了實驗依據(jù)。

[1]Tomita N，Morishita R，Tomita T，et al.Potential therapeutic applications of decoy oligonucleotides[J].CurrOpin Mol Ther，2002，4(2):166-170.

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[3]孫藝平，趙永順，于德欽，等.匹羅卡品致癇大鼠腦內(nèi)NF-κB及COX-2的表達(dá)[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2008，24(4):421-424.

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