于 飛,衛(wèi)濤濤

(1.西北師范大學(xué)體育學(xué)院,甘肅 蘭州 730070;2.中國科學(xué)院生物物理研究所,北京 100000)

許多蔬菜、水果、中草藥不僅含有許多人體必需的營養(yǎng)素,還有豐富的抗氧化成份。復(fù)合天然抗氧化制劑是果、蔬、中草藥復(fù)合制劑,主要有胡蘿卜、番茄、芹菜和茄子等蔬菜,枸杞、沙棘、茶葉等中草藥和葡萄等水果。以上主要原料中,均含有天然抗氧化劑,如胡蘿卜中含有大量的β-胡蘿卜素、蕃茄中富含番茄紅素、芹菜中富含芹菜黃素、茄子中富含原花青素、枸杞中富含枸杞多糖、沙棘中沙棘油、茶葉中的茶多酚等,復(fù)合天然抗氧化劑是多糖類、多酚類、黃酮類的協(xié)同作用和科學(xué)配制,主要用作清除生物體內(nèi)過多自由基。為此,對(duì)它的抗氧化性能、抗運(yùn)動(dòng)疲勞作用及抗氧化應(yīng)激神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)功能進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 抗氧化性能研究

1.1.2 對(duì)·OH的清除作用的測(cè)定10μl復(fù)合天然抗氧化劑(用 PBS適當(dāng)稀釋)與 10μl 1.2 mmol/L FeSo4溶液、10μl 0.4 mol/L DMPO溶液、10μl 1.0mol/L H2O2溶液混勻 90S后,用Varian E-109順磁波譜儀記錄 ESR波譜,通過第二條峰的高度表示體系中·OH的量。

1.1.3 對(duì)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)抑制作用的測(cè)定10μl S861(用PBS適當(dāng)稀釋)與10μl小鼠腦勻漿(含0.1蛋白),10μl 5 mmol/L FeCL3/1.5 mmol/L FeSO4溶液、10μl 0.1 mol/L POBN溶液混勻,37℃溫育1 h后立即用Bruker E-200順磁波譜儀記錄ESR波譜,通過第二組峰的高度表示體系中脂類自由基的量。

1.2 抗運(yùn)動(dòng)疲勞效果測(cè)定

主要測(cè)試小鼠力竭性游泳的持續(xù)時(shí)間、肝臟和骨骼肌中SOD活力及MDA含量。

昆明種成年健康雄性小鼠80只,體重(25±3)g。隨機(jī)分為3組:各組均用標(biāo)準(zhǔn)固體混合飼料喂養(yǎng),唯飲水不同:空白和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組均用普通冷開水,實(shí)驗(yàn)組在普通冷開水中加入10%制劑原液。第5d進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)前禁食禁水12h。將實(shí)驗(yàn)組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的小鼠稱重后強(qiáng)迫游泳。水深30,水溫(30±2)℃。力竭性游泳持續(xù)時(shí)間為自小鼠入水始,至沉底8S鐘不能浮出水面止。沉底小鼠立即撈起斷頭處死,取肝臟、股四頭肌的置液氮罐保存,備測(cè)SOD活力和MDA含量。用氮藍(lán)四唑NBT法測(cè)定肝臟和骨骼肌中SOD活力。用硫代巴比妥酸TBA熒光比色法測(cè)定肝臟和骨骼肌中MDA的生成量。

1.3 抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)腦細(xì)胞凋亡

主要通過測(cè)定經(jīng)FeSo4處理后的腦細(xì)胞存活率和凋亡率來觀察復(fù)合天然抗氧化制劑對(duì)腦細(xì)胞的保護(hù)功能。

取7日齡Wistar大鼠小腦,用Hanks液洗一遍,經(jīng)胰蛋白酶作用后制成細(xì)胞懸液,置于經(jīng)多聚賴氨酸包被的96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。培養(yǎng)基為添加 KCL(19.6mmol/L),glutamine(2 mmol/L)、HEPES(10mmol/L)和胎牛血清 (10%,V/V)的DMEM。細(xì)胞在37℃培養(yǎng)48h后加入200μmol/L FeSO4,制備成氧化應(yīng)激損傷腦細(xì)胞的模型供試。實(shí)驗(yàn)組在加入FeSO4之前,先加復(fù)合天然抗氧化制劑(終濃度2.5%原液)預(yù)處理15 min;對(duì)照組則不經(jīng)復(fù)合天然抗氧化制劑預(yù)處理。加入Fe-SO4處理36 h后,加入0.5mg/ml MTT溫育2 h,生成的沉淀用DMSO溶解后,測(cè)定570nm處的吸光度,計(jì)算細(xì)胞存活率。加入FeSO4處理36h后,將細(xì)胞收集到冷PBS中,用PBS洗兩遍后再用70%乙醇在-20℃固定過夜。將細(xì)胞再洗三遍后加入0.1mg/ml RNaseA 37℃作用30min,作 PI染色。用Beckman Dickison FACScan流式細(xì)胞儀測(cè)定1×104cells的DNA含量。計(jì)算凋亡細(xì)胞的比率。

2 結(jié)果

2.1 抗氧化性能

(1)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組的ESR波譜峰值顯著降低。提示實(shí)驗(yàn)組的量顯著減少(圖1) 。

Fig.1 ESR spectrogram of

(2)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組的ESR波譜峰值顯著降低。提示實(shí)驗(yàn)組·OH的量顯著減少(圖2)。

經(jīng)測(cè)定,復(fù)合天然抗氧化制劑對(duì)·OH也有極強(qiáng)的清除作用,但不及對(duì)的清除強(qiáng)度。100%原液濃度即可清除100%的·OH;50%原液濃度可清除56.7%±5.8%的·OH;25%原液濃度可清除28.5%±2.3%的·OH;12.5%原液濃度可清除14.8%±3.3%的·OH。

Fig.2 ESR spectrogram of·OH

(3)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組的ESR波譜峰值顯著降低。提示實(shí)驗(yàn)組能顯著抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)(圖3)。

Fig.3 ESR spectrogram of L

經(jīng)測(cè)定,復(fù)合天然抗氧化制劑對(duì)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有很強(qiáng)的抑制作用:只需6.3%濃度原液,即可達(dá)到28.8%±3.3%抑制率;12.5%濃度原液,可達(dá)到45.5%±2.3%抑制率;25%濃度原液,可達(dá)到50.8%±5.8%抑制率;100%濃度原液,可達(dá)88.0%±5.8%抑制率。

2.2 抗運(yùn)動(dòng)性疲勞

(1)力竭性游泳持續(xù)時(shí)間:實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(180±37)min,實(shí)驗(yàn)組(260±45)min,較對(duì)照組延長80min,超過44%(P<0.01)。

(2)SOD活力及MDA含量:實(shí)驗(yàn)組的SOD活力及MDA含量均顯著優(yōu)于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組 (表1見下頁)。

2.3 抗神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷

2.3.1 腦細(xì)胞存活率 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的細(xì)胞存活率為59.6%;實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率為84.6%。提示復(fù)合天然抗氧化制劑對(duì)腦細(xì)胞在200μmol/L FeSO4作用下有很好的保護(hù)作用(圖4見下頁)。

Tab.1 Effect from the mixed natural antioxidant on the content of MDA and the vigor of SOD of liver and muscle of athletic fatigued rats()

Tab.1 Effect from the mixed natural antioxidant on the content of MDA and the vigor of SOD of liver and muscle of athletic fatigued rats()

＊P<0.05,＊＊ P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsexperiment control

Group n SOD(U/g)Liver Muscle MDA(nmol/ml)Liver Muscle Control 40 6161±857 1875±345 1.28±0.31 1.16±0.56 Experiment control 20 5277±764＊＊ 1628±350＊ 1.80±0.38＊＊ 1.87±0.53＊＊Experiment 20 5506±626＊＊# 1719±271 1.43±0.21## 1.33±0.45#

Fig.4 Effect from the mixed natural antioxidant on the survival rate of oxidated injured brain cells

2.3.2 腦細(xì)胞凋亡率 不經(jīng)過FeSO4處理的空白對(duì)照組,只有8.4%左右發(fā)生凋亡,實(shí)驗(yàn)對(duì)照組有40.5%凋亡;實(shí)驗(yàn)組僅16.7%凋亡。提示復(fù)合天然抗氧化制劑有很強(qiáng)的保護(hù)腦細(xì)胞,顯著減少FeSO4引起的腦細(xì)胞凋亡(圖5)。

Fig.5 Effect from the mixed natural antioxidant on the apoptosis rate of oxidated injured brain cells

3 討論

3.1 復(fù)合天然抗氧化劑具有整體防御功能和較強(qiáng)的抗氧化性能

實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組的ESR波譜峰值顯著降低。只需25%原液濃度即可清除 100%,并且清除過量的可以減輕自由基損傷。研究表明復(fù)合天然抗氧化劑對(duì)O有極強(qiáng)的清除作用。

·OH是活性氧中對(duì)生物體毒性最強(qiáng)、危害最大的一種自由基。·OH是脂質(zhì)過氧化作用的主要引發(fā)劑[1]。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定,它不僅能100%地清除·OH,而且只需50%濃度原液,即能55%清除·OH。表明復(fù)合天然抗氧化制劑對(duì)·OH也有極強(qiáng)的清除作用。只需25%濃度原液就能抑制50%以上的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。

3.2 復(fù)合天然抗氧化劑的抗運(yùn)動(dòng)疲勞性能

復(fù)合天然抗氧化制劑能顯著延長小鼠游泳的持續(xù)時(shí)間,延緩運(yùn)動(dòng)性疲勞的出現(xiàn),這與其抗氧化性能關(guān)系密切,運(yùn)動(dòng)疲勞研究水平由細(xì)胞、亞細(xì)胞深入到分子和離子水平,特別是自由基生物學(xué)在體育領(lǐng)域的研究和開展,對(duì)促進(jìn)運(yùn)動(dòng)疲勞機(jī)制的研究起到積極作用[2]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,實(shí)驗(yàn)組肝臟中SOD活力顯著低于空白對(duì)照組(P<0.01);實(shí)驗(yàn)對(duì)照組肝臟、骨骼肌中SOD活力顯著低于空白對(duì)照組(P<0.01,P<0.05);實(shí)驗(yàn)組肝臟、骨骼肌中SOD活力顯著高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。表明力竭性游泳運(yùn)動(dòng)可引起小鼠肝臟和骨骼肌中超氧陰離子自由基生成增加,脂質(zhì)過氧化加強(qiáng);長時(shí)間耐力運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠肝臟和骨骼肌中MDA含量明顯增加,而實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟和骨骼肌中MDA含量顯著低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。MDA過多是細(xì)胞氧化損傷和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的重要指標(biāo),本研究結(jié)果顯示復(fù)合天然抗氧化劑能明顯清除·OH,抑制MDA生成作用,減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[3]。

3.3 復(fù)合天然抗氧化劑對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)腦細(xì)胞凋亡的影響

大量證據(jù)表明,運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的自由基損傷和超氧化損傷涉及全身各個(gè)器官和組織,腦作為生物體的中樞,與其他組織相比,更易于受到氧化損傷[4]。首先,腦組織自身代謝速率快,氧消耗量很高,會(huì)產(chǎn)生較多量的活性氧;其次,神經(jīng)細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸含量很高,容易受到活性氧攻擊;再次,由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中相對(duì)較低的過氧化氫酶和谷胱甘肽氧化酶,因此,抗氧化能力較差。一旦運(yùn)動(dòng)使腦相對(duì)缺血缺氧,就會(huì)導(dǎo)致其微循環(huán)發(fā)生改變,從而影響腦的功能,使機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力下降[5]。

研究結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率為84.6%,實(shí)驗(yàn)對(duì)照組為59.6%;不經(jīng)過FeSO4處理的空白對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為8.4%,實(shí)驗(yàn)組僅16.7%,實(shí)驗(yàn)對(duì)照組為40.5%。用復(fù)合天然抗氧化劑預(yù)處理的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞能提高生存率,抑制細(xì)胞凋亡,顯著保護(hù)腦細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。

[1]周 玫,陳 媛主編.脂質(zhì)過氧化作用及其對(duì)細(xì)胞的損傷.自由基醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與病理生理[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002.36-58.

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