張培琴

（貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴陽市 550001）

眼保Ⅱ號(hào)膠囊是我院老中醫(yī)經(jīng)過幾十年臨床經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)中醫(yī)藥學(xué)理論研制而成的純中藥復(fù)方制劑，由決明子、丹參、山藥、茯苓等15味中藥組成，具有清肝養(yǎng)肝、滋腎明目之功效，主要用于近視、視疲勞、眼底血管病變、眼底視網(wǎng)膜病變的治療。目前，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有常規(guī)膠囊劑檢查項(xiàng)目和薄層色譜定性鑒別，未對(duì)處方中主要有效成分建立質(zhì)量控制項(xiàng)目。決明子為方中君藥，性味甘、苦、咸、微寒，歸肝、大腸經(jīng)，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清熱明目、潤(rùn)腸通便之效，主治目赤澀痛、羞明多淚、頭痛眩暈、目暗不明、大便秘結(jié)。多年來，國、內(nèi)外學(xué)者在決明子的化學(xué)成分方面做了大量研究，發(fā)現(xiàn)決明子中含蒽醌類、萘駢吡喃酮類、脂肪酸類、氨基酸和無機(jī)元素等，主要成分為蒽醌類，其中大黃酚為主要有效成分[1]。因此，筆者以2005年版《中國藥典》（一部）決明子的含量測(cè)定方法為依據(jù)[2]，對(duì)眼保Ⅱ號(hào)膠囊中決明子的主要有效成分——大黃酚進(jìn)行了含量測(cè)定。

1 材料

1.1 儀器

1100型高效液相色譜（HPLC）儀，包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、VWD檢測(cè)器、柱溫箱、1100化學(xué)工作站（美國Agilent公司）；AB265-S型電子分析天平（瑞士Metler Toledo公司）；KQ-200KDB型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

大黃酚對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110769-200514）；眼保Ⅱ號(hào)膠囊（本院自制，規(guī)格：每粒0.44 g，批號(hào)：080701、080805、080909、080923、081125）；決明子藥材（貴州貴陽濟(jì)仁堂中藥飲片廠，批號(hào)：20080402）；甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：無水甲醇-0.1%磷酸溶液（87∶13），用前以0.45μm微孔濾膜濾過；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：25 ℃。理論塔板數(shù)按大黃酚計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取大黃酚對(duì)照品適量，加無水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）制成濃度約20 μg·mL-1的溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取樣品約5.0 g，精密稱定，置具塞瓶中，加甲醇50 mL，精密吸取，稱重，加熱回流30 min，放冷，再稱重，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液25 mL，置燒瓶中，揮去甲醇，殘?jiān)?0%鹽酸溶液30 mL，水浴中加熱水解1 h，放冷后以三氯甲烷強(qiáng)力振搖萃取4次，每次30 mL，合并三氯甲烷液并回收至干，殘?jiān)?0 mL量瓶中，用無水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。用前以0.45μm微孔濾膜濾過。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 取不含決明子的處方藥材，根據(jù)眼保Ⅱ號(hào)膠囊生產(chǎn)工藝制備不含決明子的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 決明子藥材溶液 取決明子藥材，干燥，粉碎，過5號(hào)篩，取藥粉約0.5 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備決明子藥材溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液、決明子藥材溶液各10μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，供試品色譜中指標(biāo)成分與相鄰峰分離度為5.17，理論塔板數(shù)以決明子峰計(jì)算＞3000；陰性對(duì)照在大黃酚峰位置處無峰出現(xiàn)，表明本法專屬性好。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.大黃酚對(duì)照品；B.供試品；C.決明子藥材；D.陰性對(duì)照Fig 1 HPLC chromatogramsA.chrysophanol control；B.test sample；C.C.obtusifolia；D.negative control

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取大黃酚對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、12、14、16 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝4798.63X－2.79（r＝0.9999）。結(jié)果表明，大黃酚進(jìn)樣量在0.0426～0.3408μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，室溫下放置，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、1、2、4、8、12、24 h各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定。結(jié)果，平均峰面積為794.93，RSD＝1.11%，表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果，平均峰面積為811.38，RSD＝0.26%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批眼保Ⅱ號(hào)膠囊內(nèi)容物適量，共6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果，樣品平均含量為0.034 mg·g-1，RSD＝1.33%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品，分別精密加入一定量的大黃酚對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.9 樣品含量測(cè)定

分別取5個(gè)批號(hào)眼保Ⅱ號(hào)膠囊內(nèi)容物適量，共3份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定樣品中大黃酚的含量。結(jié)果，5批樣品中大黃酚的平均含量分別為0.027、0.034、0.025、0.030、0.023 mg·g-1，RSD分別為2.4%、2.0%、1.9%、2.2%、1.6%。

3 討論

本試驗(yàn)考察了樣品提取方法（回流提取與超聲提?。?、水解時(shí)間及流動(dòng)相的比例。結(jié)果表明，回流30 min，水解60 min，以無水甲醇-0.1%磷酸溶液（87：13）為流動(dòng)相為最佳方案。

筆者曾參考有關(guān)決明子及其復(fù)方制劑的含量測(cè)定方法[3～5]用于本制劑的測(cè)定，但其結(jié)果均不理想。后采用文中方法，簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于眼保Ⅱ號(hào)膠囊的質(zhì)量控制。本試驗(yàn)所得5批樣品含量測(cè)定結(jié)果相差較大，可能與決明子產(chǎn)地不同有關(guān)[6]。

[1]郝延軍，桑育黎，趙余慶.決明子的研究進(jìn)展[J].中草藥，2001，32（9）：858.

[2]國家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：98.

[3]鮑銀童，金 純，劉長(zhǎng)寶，等.HPLC測(cè)定金氏痔瘡膏中大黃素和大黃酚含量[J].中成藥，2005，27（11）：1358.

[4]鄭 妍，李曉珍，高 宏.HPLC法測(cè)定柔脈顆粒中大黃酚的含量[J].中國新醫(yī)藥，2003，2（10）：20.

[5]鄢海燕，鄒純才，方洪壯.決明子生品及炮制品的HPLC指紋特征研究[J].中國藥房，2009，20（30）：204.

[6]劉 芳，陳建偉.HPLC測(cè)定炒決明子中總大黃酚的含量[J].中成藥，2005，27（5）：549.