霍仕霞，閆明，劉曉東，張?zhí)m蘭（1.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，烏魯木齊市 830049；.石河子大學(xué)藥學(xué)院，石河子市 83000）

白花丹為白花丹科植物，多為民族藥材，廣西壯醫(yī)用其葉治療跌打損傷、肝脾腫大；云南傣醫(yī)用其干根以祛風(fēng)除濕、散瘀消腫，治風(fēng)濕疼痛、肝區(qū)疼痛；新疆維吾爾醫(yī)用其莖枝，稱作“夏特然吉印地”，多由巴基斯坦或印度購(gòu)入，常以配方入丸、膏藥用，主治白癜風(fēng)、偏癱、胃腹脹痛及牛皮癬等證[1]。目前，對(duì)其化學(xué)成分及抗腫瘤作用研究較多，其主要含有萘醌類物質(zhì)，但關(guān)于微量元素研究較少。筆者首次結(jié)合現(xiàn)代先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)其微量元素進(jìn)行測(cè)定，建立相應(yīng)的測(cè)定方法，提供準(zhǔn)確的微量元素含量數(shù)據(jù)，為今后研究其作用機(jī)制提供基礎(chǔ)和信息。

1 材料

1.1 儀器

ICP-1000型電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICP-AES）儀（日本島津公司）；AF-640型原子熒光（AFS）分光光度計(jì)（北京瑞利公司）；高壓消解罐（上海冶金研究院）；AE163型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；EG35A型電熱板（北京永光明醫(yī)療儀器廠）。

1.2 試藥

白花丹購(gòu)于新疆維吾爾醫(yī)醫(yī)院藥房，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所張彥福研究員鑒定為白花丹科植物Plumbago zeylanica的地上部分；茶葉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW07605），銅（Cu）、鋅（Zn）、鐵（Fe）、鈣（Ca）、鎂（Mg）、錳（Mn）、鍶（Sr）的標(biāo)準(zhǔn)液（1000 μg·mL-1），硒（Se）標(biāo)準(zhǔn)液（100 μg·mL-1）均購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；硼氫化鈉（NaBH4）、鐵氰化鉀（K3Fe（CN）6）均為分析純，鹽酸（HCl）、硝酸（HNO3）、氫氧化鈉（NaOH）、過氧化氫（H2O2）均為優(yōu)級(jí)純，實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 儀器工作條件

ICP-1000型ICP-AES儀，入射功率為1.2 kW，反射功率＜5 kW，輔助氣流量為1.2 L·min-1，冷卻氣流量為11 L·min-1，光柵刻線為1920條·mm-1，觀察高度為負(fù)載線圈上15 cm，積分時(shí)間為20 s；AF-640型AFS分光光度計(jì)，光電倍增管（P-MT）電壓為270 V，采樣泵速為100 r·min-1，載氣流量為600 mL·min-1，輔助氣流量為200 mL·min-1，原子化器溫度為200℃，原子化方式為火焰法，采樣時(shí)間為8 s，注入泵速為100 r·min-1，注入時(shí)間為22 s，讀數(shù)時(shí)間為17.0 s，延時(shí)時(shí)間為2.0 s。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

2.2.1 ICP-AES法混合標(biāo)準(zhǔn)液：采用儀器設(shè)定的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：Mn、Sr濃度為 10 μg·mL-1，Cu、Zn 為 10 μg·mL-1，Ca為200 μg·mL-1，Mg為20 μg·mL-1，F(xiàn)e為100 μg·mL-1。

2.2.2 Se單標(biāo)系列溶液：將Se標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg·mL-1）用10%鹽酸溶液分別稀釋成1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、20.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液，在選定的儀器操作條件下進(jìn)行測(cè)試，得線性方程為Y＝0.016X+0.2474（r＝0.9991），表明 Se元素濃度范圍在1.0～20.0 μg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 樣品處理

2.3.1 ICP-AES法樣品處理[2]：將白花丹用自來水洗凈，再用去離子水沖洗3遍，置于100℃烘箱中干燥，粉碎過80目篩，精密稱定樣品0.5 g，置于高壓消解罐中，加消解液8.00 mL（HNO3∶H2O2＝3∶1），置于烘箱中150 ℃加熱消化，1 h后取出消化罐冷卻，將消化罐中的溶液全部轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中，去離子水定容，同時(shí)做空白試驗(yàn)。

2.3.2 AFS法樣品處理[3，4]：精密稱定白花丹藥材粉末（過80目篩）0.5 g，置于高腳燒杯中，加10.0 mL混合酸（硝酸∶高氯酸＝1∶1），蓋上表面皿，冷浸過夜，次日于電熱板上200℃下加熱處理，并及時(shí)補(bǔ)加混合酸，當(dāng)溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙時(shí)，再繼續(xù)加熱至剩余體積2 mL左右，切不可蒸干。冷卻，再加5 mL鹽酸（6 mol·L-1），繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)闊o色并伴有白煙出現(xiàn)，以完全將Se6+還原成Se4+。冷卻，轉(zhuǎn)移定容至50 mL容量瓶中，同時(shí)做空白試驗(yàn)。

2.4 分析波長(zhǎng)選擇及檢測(cè)限

試驗(yàn)中，通過ICP-AES儀的同步校正功能對(duì)每個(gè)測(cè)定元素選取3條譜線進(jìn)行測(cè)定，綜合分析強(qiáng)度、干擾情況及穩(wěn)定性，選擇譜線干擾少、精密度好的分析線作為最佳分析波長(zhǎng)。在最佳分析波長(zhǎng)下，對(duì)空白溶液連續(xù)測(cè)定11次，取3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差所對(duì)應(yīng)的濃度為各元素的檢出限。結(jié)果，Cu、Zn、Fe、Ca、Mg、Mn、Sr、Se元素的檢測(cè)波長(zhǎng)及檢測(cè)限分別為324.8 nm、0.0060 μg·L-1，213.8 nm、0.0060 μg·L-1，248.3 nm、0.0040 μg·L-1，422.7 nm、0.0012 μg·L-1，285.2 nm、0.0081 μg·L-1，280.1 nm、0.0024 μg·L-1，460.7 nm、0.0020 μg·L-1，196.026 nm、0.0465 μg·L-1。

2.5 測(cè)定結(jié)果

按“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品，平行5份，在“2.1”項(xiàng)下儀器工作條件下，ICP-AES法同時(shí)測(cè)定樣品中Cu、Zn、Fe、Ca、Mg、Mn、Sr元素，AFS法測(cè)定Se元素，每份樣品連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算平均值。結(jié)果，各元素含量測(cè)定結(jié)果及RSD分別對(duì)應(yīng)為5.28 μ g·g-1、1.67%，14.87 μg·g-1、2.61%，64.77 μg·g-1、1.97%，2880.34 μg·g-1、3.01%，1501.45 μg·g-1、1.15%，8.37 μg·g-1、0.78%，21.03 μg·g-1、0.84%，213.64 μg·g-1、2.12%。

2.6 回收率試驗(yàn)[5]

根據(jù)測(cè)得的各元素含量數(shù)據(jù)，對(duì)本方法進(jìn)行回收率考察。精密稱定6份白花丹粉末0.5 g，另取6份加入同一劑量Se元素標(biāo)準(zhǔn)液，按“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品，測(cè)定時(shí)根據(jù)各元素含量測(cè)定預(yù)試結(jié)果稀釋至所需倍數(shù)，采用最佳試驗(yàn)條件進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 方法回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab 1 Results of recovery test（n＝5）

2.7 質(zhì)量控制

為了進(jìn)一步考察試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度，采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)茶葉（GBW07605）樣品進(jìn)行測(cè)定，平行測(cè)定3次，結(jié)果見表2。

3 討論

本試驗(yàn)采用高壓消解罐處理樣品，并采用HNO3-H2O2消化液體系，通過高溫加壓能快速有效地將樣品消化，既節(jié)省時(shí)間，又避免使用高氯酸消解樣品可能帶來的危險(xiǎn)，同時(shí)克服了傳統(tǒng)的濕法消解和干灰化法造成的空白值增高及待測(cè)元素?fù)p失的缺點(diǎn)，是植物樣品前處理的理想方法。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab 2 Results of content determination of samples

采用ICP-AES法對(duì)白花丹中Cu、Zn、Fe、Ca、Mg、Mn、Sr 7種元素同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，精密度及回收率均良好，且質(zhì)控樣品的測(cè)定結(jié)果均在標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)，滿足微量分析的要求。ICP-1000型ICP-AES儀線性范圍較寬，避免了樣品稀釋所帶來的誤差，適用于常量及微量元素的同時(shí)測(cè)定。

目前，測(cè)定Se元素大多采用2，3-二氨基萘熒光法及紫外分光光度法，不僅操作煩瑣，而且會(huì)引入很多有機(jī)試劑及毒性物質(zhì)。本試驗(yàn)采用AFS法，簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高，其中樣品處理是關(guān)鍵。試驗(yàn)中樣品處理方法參考國(guó)標(biāo)食品中Se元素的測(cè)定（GB/T5009.93-2003），其原理是樣品經(jīng)酸加熱消化后，在6 mol·L-1HCl介質(zhì)中將樣品中的 Se6+還原成 Se4+，用 NaBH4作還原劑，將Se4+還原成硒化氫，由載氣代入原子化器中進(jìn)行原子化，進(jìn)行測(cè)定；測(cè)定時(shí)，因其它金屬離子的存在會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果有干擾，故加入K3Fe（CN）6溶液可掩蔽金屬離子，消除干擾，增強(qiáng)熒光的強(qiáng)度，提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

由樣品測(cè)定結(jié)果可以看出，白花丹中含有非常豐富的Se元素，且Cu、Fe、Ca、Mg、Mn、Sr元素也較豐富。其中，F(xiàn)e、Ca、Mg均為人體內(nèi)的常量元素，在人體內(nèi)具有廣泛、重要的生理生化功能，參與酶的構(gòu)成，構(gòu)成體內(nèi)重要的載體及電子傳遞，參與激素與維生素的合成及相關(guān)細(xì)胞的分化和基因表達(dá)，影響內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)控水平，維持身體正常的生理功能。豐富的Cu、Zn、Mn是人體上百種酶的組成成分和激活因子，Zn參與核酸和蛋白質(zhì)的合成，并影響著細(xì)胞分裂生長(zhǎng)和再生；Mn是公認(rèn)的抗癌元素，在信息的傳遞、自由基的生成和滅活、內(nèi)分泌活動(dòng)、中樞神經(jīng)功能、維持動(dòng)脈的結(jié)構(gòu)及功能等方面均發(fā)揮重要作用；Cu還參與抗炎的作用，體內(nèi)缺少Cu、Zn元素會(huì)出現(xiàn)過早的白發(fā)[6]。Se是谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）的組成成分，它可分解體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物及H2O2，具有保護(hù)機(jī)體免受氧化損害的作用。大量研究報(bào)道[7]，Se具有抗腫瘤、抗肝纖維化、抑制免疫排斥等作用；且Se與視力和神經(jīng)傳導(dǎo)也有密切的關(guān)系。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，Se在腫瘤防治中有重要作用；Se還可與其它抗癌藥物產(chǎn)生協(xié)同作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞系凋亡；含Se元素的酶通過調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄抑制表面免疫分子MHC-Ⅱ、CD8、IL-2R和ICAM-I的表達(dá)，從而起到抗肝纖維化的作用。趙鐵建等[8]研究發(fā)現(xiàn)白花丹具有抗腫瘤、抗肝纖維化、抗氧化及中樞興奮等藥理作用，且作用顯著，但尚未進(jìn)一步對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行研究。本試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明，白花丹中Se元素含量異常的高，這可能與白花丹抗腫瘤、抗肝纖維化、抗氧化等作用有很大的相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)，白花丹中活性成分主要為萘醌類，而萘醌類物質(zhì)具有較高超離域度的大π鍵共軛體系、較強(qiáng)的配位氧原子與合適的空間構(gòu)型，可作為金屬離子的螯合配體，故考慮白花丹中起作用的成分很有可能是以某種金屬元素為中心的萘醌類成分的配合物。且白花丹有毒性作用，也可能與其含有大量的Se元素有關(guān)，適量的Se元素能夠起到很重要的生物學(xué)效應(yīng)，過量就會(huì)產(chǎn)生副作用，乃至毒性作用，故在白花丹藥材的使用中，大多嚴(yán)格限制用量。關(guān)于其微量元素的作用機(jī)制及作用形式有待進(jìn)一步研究，而微量元素的研究將有助于白花丹作用機(jī)制的進(jìn)一步探討。

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