梁 潔，甄漢深，李生茂，李吾來，張薇薇（廣西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，南寧市 530001）

美味獼猴桃（Acitinidia deliciosa）為獼猴桃科獼猴桃屬植物，性寒，味酸、甘，有小毒，具有清熱、利尿、活血、消腫的功效，適用于治療肝炎、水腫、跌打損傷、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、淋濁、帶下、瘡癤等證[1，2]。現(xiàn)代研究表明，美味獼猴桃根提取物具有抗腫瘤和保肝作用[3～6]。本課題組曾對廣西產(chǎn)美味獼猴桃根的化學(xué)成分進(jìn)行研究，從抗腫瘤活性部位分離得到6個三萜類化合物[7]。在對美味獼猴桃根的三萜類成分體外抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)分離得到的2α，3α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸的抗腫瘤活性較強(qiáng)，含量較高；該三萜化合物曾在毛花獼猴桃根中分離得到[8]，但在美味獼猴桃根中為首次分離得到[7]。通過文獻(xiàn)調(diào)研，迄今為止，尚未見用高效液相色譜（HPLC）法測定美味獼猴桃根中2α，3α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸含量的報道。因此，筆者采用HPLC法對該三萜化合物進(jìn)行含量測定，為美味獼猴桃根的內(nèi)在質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1100 series HPLC儀，含G-1322A在線真空脫氣機(jī)、G-1311A高壓四元泵、G-1313A標(biāo)準(zhǔn)自動進(jìn)樣器、G-1316A智能化柱溫箱、G-1313A可變波長檢測器、二極管陣列檢測器、1100 series色譜工作站（美國安捷倫科技公司）；CG-16W型高速微量離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；SB3200T型超聲波清洗儀（上海必能信超聲有限公司）；Millipore Simplicity-185型超純水儀（美國密里博公司）；BP211D型電子分析天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 試藥

美味獼猴桃根采于廣西桂林（市雁山植物園及資源縣、興安縣、全州縣、龍勝縣），經(jīng)中國科學(xué)院廣西植物研究所植物分類室鑒定來源為獼猴桃科獼猴桃屬植物美味獼猴桃A.deliciosa C.F.Liang et A.R.Ferguson，標(biāo)本存于廣西中醫(yī)學(xué)院藥物分析教研室；2α，3α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸標(biāo)準(zhǔn)品（本課題組從美味獼猴桃根藥材中分離得到，經(jīng)HPLC檢測、面積歸一化法計算，純度＞98%）；甲醇（色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）；水為超純水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Thermo Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-0.2%磷酸水溶液（73∶27）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：210 nm；柱溫：20 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)以2α，3α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸峰計算應(yīng)不低于5000。色譜見圖1。

2.2 提取方法的考察

2.2.1 提取溶劑的考察 筆者分別比較了20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇和無水乙醇對美味獼猴桃根2α，3α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸的提取效果。精密稱取美味獼猴桃根粗粉（過24目篩）5份，每份約1.0 g，置具塞錐形瓶中，分別加入上述提取溶劑各20 mL，稱重，超聲處理40 min，放冷，再稱重，分別加入上述提取溶劑補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液進(jìn)行含量測定。結(jié)果，20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇和無水乙醇提取2α，3α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸的含量分別為0.803、1.876、2.869、1.028、0.631 mg·g-1，可見60%乙醇的提取率最高。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品（廣西桂林市雁山植物園）；C.空白溶劑（甲醇）；1.2α，3α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.control substance；B.test sample（from Guilin Yanshan Botanical Garden）；C.blank solvent（methanol）；1.2α,3α,24-trihydroxyursa-12-en-28-oic acid

2.2.2 提取方法的考察 試驗(yàn)比較了水浴回流、超聲和冷浸3種提取方法對美味獼猴桃根2α，3α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸的提取效果。精密稱取美味獼猴桃根粗粉（過24目篩）3份，每份約1.0 g，分別加入70%乙醇20 mL，采用以上3種提取方法分別提取1 h，取續(xù)濾液進(jìn)行含量測定。結(jié)果，水浴回流提取、超聲提取和冷浸提取2α，3α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸的含量分別為1.871、2.362、0.857 mg·g-1，可見超聲提取法的提取率最高。

2.2.3 最佳提取方法的確定 采用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取方法，考察了提取溶劑、溶劑用量、提取時間和提取次數(shù)對提取結(jié)果的影響。結(jié)果表明，最佳提取方法為以25倍量的50%乙醇超聲提取2次，每次40 min。

2.3 含量測定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液的制備 精密稱取2α，3α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸標(biāo)準(zhǔn)品12.5 mg，置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為0.5 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。

2.3.2 供試品溶液的制備 采用正交試驗(yàn)所得的最佳方法進(jìn)行提取，取藥材粗粉（過24目篩）約1 g，精密稱定，精密加入50%乙醇25 mL，稱重，超聲處理2次，每次40 min，放冷，再稱重，用50%乙醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，合并2次濾液，離心，取上清液，即得。

2.3.3 線性關(guān)系考察 取上述標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，分別吸取0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mL，置1 mL量瓶中，以甲醇定容，得不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣10 μL，測定峰面積積分值。以對照品濃度（X，mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝2204.28333X－4.2004454（r＝0.9998）。結(jié)果表明，2α，3α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸標(biāo)準(zhǔn)品的檢測濃度在0.025～0.200 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取2α，3α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.1 mg·mL-1）10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果，RSD＝0.62%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，每份約1 g，精密稱定，分別按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，依法測定含量。結(jié)果，2α，3α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸的平均含量為3.109 mg·g-1，RSD＝1.77%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，按上述色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、24 h各進(jìn)樣10 μL，測定2α，3α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸的峰面積。結(jié)果，RSD＝1.70%（n＝7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批樣品6份，每份約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入0.5 mg·mL-1的2α，3 α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液3 mL，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，依法測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.3.8 樣品含量測定 分別稱取5批不同產(chǎn)地美味獼猴桃根藥材粗粉，分別按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測定，以外標(biāo)法計算含量，結(jié)果見表2。

表2 不同產(chǎn)地美味獼猴桃根中2α，3α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Content determination of 2 α,3 α,24-trihydroxyursa-12-en-28-oic acid in roots of acitinidia deliciosa from different habitats（n＝3）

3 討論

取2α，3α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在190～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，得其最大吸收波長為204 nm，但溶劑甲醇在短波長處均有吸收，為了減少干擾，又盡量不降低靈敏度，選擇210 nm作為檢測波長。

筆者根據(jù)實(shí)際情況和五環(huán)三萜類化合物有關(guān)含量測定的文獻(xiàn)報道[9～11]采用不同的流動相系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)中考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸和甲醇-磷酸洗脫系統(tǒng)，結(jié)果選定甲醇-0.2%磷酸水溶液（73∶27）作為流動相，主成分與其它成分均能達(dá)到基線分離，柱效高，峰形好，能夠完全滿足色譜定量的要求。

試驗(yàn)結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好，可用于廣西產(chǎn)美味獼猴桃根藥材的質(zhì)量控制。

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院編.中藥大辭典（下冊）[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1997：2211.

[2]全國中草藥匯編編寫組.全國中草藥匯編（上冊）[M].北京：科學(xué)出版社，1975：795.

[3]鐘振國，張鳳芬，甄漢深，等.美味獼猴桃根提取物抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2004，9（22）：1705.

[4]李 麗，梁 潔，甄漢深，等.美味獼猴桃根提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J].廣西中醫(yī)藥，2006，29（4）：50.

[5]李 麗，梁 潔，甄漢深，等.美味獼猴桃提取物對D-半乳糖胺誘導(dǎo)的肝損傷的影響[J].廣西醫(yī)學(xué)，2006，28（10）：1608.

[6]李 麗，鐘振國，梁 潔，等.美味獼猴桃根提取物對小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J].時珍國醫(yī)國藥，2007，18（3）：封3.

[7]梁 潔，甄漢深，李生茂，等.廣西產(chǎn)美味獼猴桃根正丁醇部位化學(xué)成分的研究[J].中國中藥雜志，2008，33（11）：1275.

[8]黃初升，張壯鑫，李干孫，等.毛花獼猴桃中的兩個新三萜化合物[J].云南植物研究，1988，10（1）：93.

[9]張前軍，趙 超，楊小生，等.高效液相色譜法測定連錢草中熊果酸的含量[J].中國中藥雜志，2006，31（18）：1533.

[10]黃麗霞，賈曉斌，陳 彥，等.HPLC法測定不同產(chǎn)地夏枯草中熊果酸的含量[J].中國藥房，2008，19（12）：910.

[11]趙君操.RP-HPLC法測定甘露消渴膠囊中熊果酸的含量[J].中國藥房，2007，18（33）：2607.