李最瓊（南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院，衡陽市 421002）

小檗堿（Ber）又名黃連素，是一種從黃連植物中提取的苯并異喹啉類季銨型生物堿[1]。Ber可作為一種廣譜抗菌藥物，對多種革蘭陰陽菌、真菌、霉菌、病毒、原蟲和線蟲等具有抑制殺滅的作用，已在臨床上應(yīng)用多年，常用于治療感染性分泌性腹泄、消化性潰瘍及胃炎、霉菌感染和慢性膽囊炎等，其療效確切，但作用機(jī)制還不明確[2]。Toll樣受體2（TLR2）屬于模式識別受體，能識別多種病原微生物的成分，如革蘭陰性和陽性菌的肽聚糖、真菌的酵母聚糖、原蟲的黏蛋白和病毒的包膜糖蛋白等[3]。因此，以TLR2的細(xì)菌脂蛋白（BLP）刺激RAW264.7細(xì)胞，研究小檗堿對TLR2信號通路和炎癥因子表達(dá)情況的影響，不但完善了小檗堿抗菌消炎的機(jī)制，而且可為擴(kuò)大其臨床應(yīng)用范圍提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

680型酶標(biāo)儀、PowerPac Basic電泳儀（美國Bio-Rad公司）；IX70型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；2300型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Sheldon公司）；SW-CJ-IF型潔凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）；Megafuge 1.0R型低溫離心機(jī)（德國Herculeus公司）；DNA/RNA測定儀（英國Pharmarcia公司）；GBox-HR DNA/蛋白質(zhì)凝膠成像系統(tǒng)（英國Syngene公司）。

1.2 試藥

BLP（采用人工合成的細(xì)菌脂蛋白Pam3CSK4·3HCl，美國Alexis公司，批號：ALX-165-066-M002）；鹽酸小檗堿（美國Sigma公司，批號：D046）；抗β肌動蛋白單克隆抗體（Anti-beta-actin mAb）、抗核因子κB 抑制性蛋白（IκB）磷酸化抗體、羊抗鼠IgG、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）干擾素-γ（IFN-γ）、干擾素-α（TNF-α）、白介素-10（IL-10）、白介素-13（IL-13）試劑盒（美國R&D公司）；Trizol試劑、DNA marker、預(yù)染蛋白marker（美國 Invitrogen公司）；TLR2、β-actin引物（上海捷瑞生物工程有限公司）；RT-PCR試劑盒（美國Fermentas公司）；Premix Taq（大連寶生物工程有限公司）；DMEM培養(yǎng)基低糖（干粉）、胎牛血清（美國Gibco-BRL公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 細(xì)胞

RAW264.7細(xì)胞系購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用含0.25%胰酶消化，20℃下125 r·min-1離心5 min，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為每1 L含4×108個(gè)，并接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔定容1 mL，于37℃下5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.2 分組和處理

實(shí)驗(yàn)分為3組，即對照、BLP、Ber（100 mol·L-1）+BLP組。對照組加 10 μL PBS；BLP 組加 10 μL BLP（終濃度 1 μg·mL-1）；Ber（100 μmol·L-1）+BLP 組先加 10 μL Ber（終濃度 100 μmol·L-1），孵育2 h后再加10 μL BLP（終濃度1 μg·mL-1），每一組均培養(yǎng)至6、12、24、48 h后收集細(xì)胞。

2.3 RT-PCR法檢測TLR2 mRNA表達(dá)

于對應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)（6、12、24、48 h）收集細(xì)胞，以Trizol試劑抽提RNA。測定RNA濃度后，取2 μg總RNA，按照試劑盒說明書加試劑，在20 μL體積下，用下列條件：65℃、5 min，65℃、42 min，70℃、5 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，接著進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。TLR2引物序列為：上游5′-GCGTTACATCTTGG AACTGTCGGA-3′，下游 5′-AGGAAGACCTTGCTGTTCTCTACTGT-3′；β-actin 引物序列為：上游5′-ATCATTGCTCCTCCTGAGCGCA-3′，下 游 5′-ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3′。按照說明書加試劑，在20 μL體積下，用下列反應(yīng)條件：94 ℃、3 min，94 ℃、40 s，55 ℃、40 s，72 ℃、1 min，72℃、10 min，30個(gè)循環(huán)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。TLR2、β-actin的擴(kuò)增產(chǎn)物分別為231、109 bp。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠分析系統(tǒng)對擴(kuò)增產(chǎn)物條帶進(jìn)行掃描，并以TLR2灰度值/β-actin灰度值作為TLR2 mRNA的半定量值。

2.4 Westren-blot檢測IκB的磷酸化水平

于對應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)（6、12、24、48 h）收集細(xì)胞，PBS 洗2次，裂解液裂解，離心，收集上清液，即細(xì)胞總蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）法定量測蛋白濃度，用等量蛋白和蛋白上樣緩沖液混合，煮沸，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳后轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜（NC膜），依次孵抗體，即抗磷酸化IκB抗體和辣根過氧化酶標(biāo)志的羊抗鼠IgG，發(fā)光顯影定影后，用Quantity one分析軟件計(jì)算條帶灰度值。

2.5 ELISA檢測炎癥因子的表達(dá)

于對應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)（6、12、24、48 h）收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照ELISA試劑盒說明書操作，具體的步驟如下：將50 μL稀釋液和50 μL 細(xì)胞培養(yǎng)上清分別加入包被有IFN-γ、TNF-α、IL-10和IL-13抗體的96孔板內(nèi)，封板，室溫孵育2 h，吸出上清后將板拍干，洗板4次，再加100μL辣根過氧化酶偶聯(lián)的抗鼠IFN-γ、TNF－α、IL-10 和IL-13抗體，封板，室溫孵育2 h，徹底洗板4次，加入100 μL四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物，室溫避光孵育30 min，加入100 μL終止液終止反應(yīng)，即刻讀取450 nm波長處吸光度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 Ber對TLR2 mRNA表達(dá)的影響

在BLP的刺激下，RAW264.7細(xì)胞顯著性高表達(dá)TLR2，并隨著刺激時(shí)間的延長而增高，具有時(shí)間依賴性；100 mol·L-1Ber在6、12 h促進(jìn)BLP誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞表達(dá)TLR2，但在24、48 h抑制BLP誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞表達(dá)。Ber對TLR2 mRNA表達(dá)的影響見圖1。

圖1 Ber對TLR2 mRNA表達(dá)的影響1.對照組；2.BLP組；3.Ber+BLP組Fig 1 Effect of Ber on TLR2 mRNAexpression1.control group；2.BLP group；3.Ber+BLP group

3.2 Ber對IκB磷酸化水平的影響

在BLP的刺激下，RAW264.7細(xì)胞內(nèi)IκB磷酸化水平顯著增高，并具有時(shí)間依賴性；100 μmol·L-1Ber在6、12 h 促進(jìn)BLP誘導(dǎo)的IκB磷酸化，但在24、48 h抑制BLP誘導(dǎo)的IκB磷酸化。Ber對IκB磷酸化水平的影響見圖2。

圖2 Ber對IκB磷酸化水平的影響1.對照組；2.BLP組；3.Ber+BLP組Fig 2 Effect of Ber on the level of phosphorylation of IκB1.control group；2.BLP group；3.Ber+BLP group

3.3 Ber對炎癥因子表達(dá)的影響

在BLP的刺激下，RAW264.7細(xì)胞顯著性高表達(dá)IFN-γ和TNF-α（P＜0.01），而100 μmol·L-1Ber在 6、12 h 顯著促進(jìn)IFN-γ和TNF-α表達(dá)，但在24、48 h 顯著抑制IFN－γ和TNF-α表達(dá)（P＜0.01或P＜0.05）；BLP的刺激不能顯著增加RAW 264.7細(xì)胞表達(dá)IL-10 和IL-13，但100 μmol·L-1Ber顯著增加BLP刺激的RAW264.7細(xì)胞表達(dá)IL-10和IL-13（P＜0.01或P＜0.05）。Ber對炎癥因子表達(dá)的影響見圖3。

4 討論

Toll樣受體（TLR）屬于模式識別受體，主要識別病原相關(guān)分子模式（PAMP），激活相應(yīng)的信號通路，誘導(dǎo)炎癥因子的釋放，并激活獲得性免疫系統(tǒng)，最終清除侵入的病原微生物。

圖3 Ber對炎癥因子表達(dá)的影響A.IFN-γ；B.TNF-α；C.IL-10；D.IL-13；1.對照組；2.BLP組；3.Ber+BLP組；與對照組比較：＊P＜0.01；與BLP組比較：#P＜0.05，##P＜0.01Fig 3 Effect of Ber on the expression of inflammatory cytokinesA.IFN-γ；B.TNF-α；C.IL-10；D.IL-13；1.control group；2.BLP group；3.Ber+BLP group；vs.control group：＊P＜0.01；vs.BLP group：#P＜0.05，##P＜0.01

TLR2是TLRs家族中表達(dá)范圍最廣、識別病原微生物及其產(chǎn)物種類最多的分子，可以在細(xì)菌、病毒、真菌及其他一些病原體感染中發(fā)揮天然免疫作用，并通過其胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而激活獲得性免疫[4]。本研究用Ber作用于BLP刺激的RAW 264.7 細(xì)胞，RT-PCR 檢測的結(jié)果表明，100 μmol·L-1Ber在6 h和12 h能夠促進(jìn)BLP刺激的RAW264.7細(xì)胞表達(dá)TLR2，但在24 h和48 h反而起到抑制的作用。這暗示著Ber可能具有雙向調(diào)節(jié)的作用。

核因子κB（NF-κB）是細(xì)胞內(nèi)參與多種細(xì)胞反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，如TLR2信號通路的傳導(dǎo)。NF-κB通過與抑制蛋白IκB的結(jié)合，以非活性的形式處在胞漿中。當(dāng)IκB被蛋白激酶磷酸化并降解后，NF-κB釋放，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，并結(jié)合于特定的DNA位點(diǎn)，啟動相應(yīng)基因的表達(dá)，如各種炎癥因子[5]。本研究中100 μmol·L-1Ber在6 h和12 h 促進(jìn)BLP 誘導(dǎo)的IκB 磷酸化，但在24 h和48 h卻抑制BLP誘導(dǎo)的IκB磷酸化。結(jié)果表明，100 μmol·L-1Ber在早期（6 h和12 h）能夠促進(jìn)BLP誘導(dǎo)的NF-κB激活，但晚期（24 h和48 h）卻起抑制的作用。

炎癥因子主要分為促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子。促炎細(xì)胞因子主要包括IFN-γ和TNF-α等，其過度升高是過度炎癥反應(yīng)的主要原因；抗炎細(xì)胞因子主要包括IL-10和IL-13等。研究表明，感染機(jī)體內(nèi)促炎細(xì)胞因子的過度升高，可刺激機(jī)體分泌抗炎細(xì)胞因子，從而減輕炎癥反應(yīng)，起到負(fù)反饋調(diào)節(jié)的作用[6，7]。本研究ELISA結(jié)果表明，100 μmol·L-1Ber在早期能夠促進(jìn)IFN-γ和TNF-α的分泌，而晚期卻抑制IFN-γ和TNF-α的分泌，但在后期（12 h、24 h和48 h）顯著性促進(jìn)抗炎因子IL-10和IL-13的分泌。這可能是過度促炎因子的分泌刺激了抗炎因子的表達(dá)，或者是Ber能促進(jìn)抗炎因子的分泌。但BLP的刺激能誘導(dǎo)促炎因子IFN-γ和TNF-α的分泌，卻不能誘導(dǎo)抗炎因子IL-10和IL-13的分泌，表明IL-10和IL-13的分泌不是由負(fù)反饋調(diào)節(jié)誘導(dǎo)，而是由Ber促進(jìn)的。

本研究表明，Ber在BLP刺激的早期，能夠促進(jìn)TLR2的表達(dá)、NF-κB的激活和促炎因子IFN-γ和TNF-α的分泌，加強(qiáng)TLR2信號通路的激活，增強(qiáng)TLR2抗病原微生物的作用；但在BLP刺激的晚期，可能是過度炎癥反應(yīng)時(shí)期，Ber反而抑制TLR2的表達(dá)、NF-κB的激活和促炎因子IFN-γ和TNF-α的分泌，抑制TLR2信號通路的激活，抑制過度炎癥反應(yīng)。并且，Ber具有促進(jìn)抗炎因子的分泌從而能抗菌消炎的作用，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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