李國英，買爾旦·馬合木提，古麗仙·胡加

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，烏魯木齊市 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊市 830011）

新疆紫草（AE）又名新疆軟紫草，藥用部位是其干燥根?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，AE具有涼血、活血、抗菌消炎、抗病毒、抗腫瘤，其水煎液能明顯抑制青春期雌性大鼠激素水平[1]等多種藥理活性，臨床上主要用于治療血熱毒盛、斑疹紫黑、瘡瘍、濕疹、水火燙傷等病癥[2]。AE中的主要成分有兩大類：一類是脂溶性很強(qiáng)的萘醌類；另一類是水溶性成分如多糖和酚酸類。萘醌類中的主要成分紫草素和乙酰紫草素具有很強(qiáng)的抑菌消炎作用，對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等有明顯的抑制作用，并能促進(jìn)上皮生長，加速創(chuàng)口愈合[3]，被廣泛用于治療各種皮膚疾病和放射性皮膚損傷。脂質(zhì)體具有與人體皮膚相似的特性，其結(jié)構(gòu)類似生物膜，可包封水溶性和脂溶性藥物，可生物降解，無毒副作用，通過轉(zhuǎn)化釋放包裹的藥物，提高生物利用度[4]。本研究以AE的脂溶性成分為基礎(chǔ)，初步探討了AE提取物（AEE）脂質(zhì)體的制備工藝，旨在為開發(fā)用于治療放射性皮膚損傷的AEE制劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

BS100型電子天平（北京奧多利斯天平有限公司）；HWS24型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；LG10-2.4A型高速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；PHSJ-3F型pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；752型紫外-可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；UV-2500（PC）Series掃描儀（日本島津公司）；JEOL1230型高分辨透射電鏡（日本電子公司）。

1.2 試藥

左旋紫草素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110769-200405）；AEE（筆者自制）；卵磷脂（北京奧博星生物技術(shù)有限公司，進(jìn)口分裝）；膽固醇（武漢生命技術(shù)有限公司，進(jìn)口分裝）；磷酸二氫鈉（分析純，天津市化學(xué)試劑三廠）；磷酸氫二鈉（分析純，天津市化學(xué)試劑三廠）；1%醋酸雙氧鈾染色劑。

2 方法與結(jié)果

2.1 AEE的提取工藝

稱取新疆紫草藥材粉末約1000 g，95%乙醇室溫反復(fù)浸提至提取液無色為止。合并濾液，過濾，濃縮，得濃縮液。濃縮液中加入2%氫氧化鈉溶液至純藍(lán)色，繼續(xù)加入稍過量濃鹽酸，靜置得沉淀，用蒸餾水反復(fù)洗至中性，45℃干燥，得紫紅色AEE結(jié)晶，得率為1.12%。

2.2 包封率的測定

以紫外-分光光度法測定；提取物中總萘醌的含量以左旋紫草素計(jì)。

2.2.1 測定波長的選擇：取左旋紫草素對照品溶液、AEE和空白脂質(zhì)體混懸液，用混合溶劑（乙醇∶乙醚＝7∶2）溶解稀釋后在200～700 nm波長之間進(jìn)行掃描。結(jié)果，左旋紫草素和AEE在516 nm波長處均有最大吸收，空白脂質(zhì)體在230 nm波長處有最大吸收。因此，選擇516 nm為測定波長。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密吸取0.05 mg·mL-1的左旋紫草素對照品溶液適量，用混合溶劑配制成系列濃度的溶液，在516 nm波長處測定其吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，對照品濃度（C，mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝31.749C+0.0027（r＝0.9999）。結(jié)果表明，對照品在0.005～0.035 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.2.3 方法學(xué)考察：依法進(jìn)行精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和回收率考察。結(jié)果，日間精密度的RSD＝0.62（n＝5）；連續(xù)制備的5批樣品的RSD＝1.53%；同一樣品連續(xù)測定5 d的RSD＝0.54%；加樣回收率為101.66%，RSD＝1.36%。均符合要求。

2.3 脂質(zhì)體制備方法的篩選[5]

為便于比較，統(tǒng)一處方為AEE 0.010 g，卵磷脂0.300 g，膽固醇0.100 g，PBS 40 mL。

2.3.1 薄膜分散法：按處方量精密稱取卵磷脂和膽固醇，置于圓底燒瓶中，加入20 mL乙醚，攪拌使溶解，再加入AEE，攪拌溶解后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上30℃蒸干成膜，然后加入PBS溶液、碎瓷片數(shù)枚，旋轉(zhuǎn)60 min使膜溶解，放置2 h使其充分水合，作為1號樣品。

2.3.2 逆相蒸發(fā)法：同上稱取卵磷脂和膽固醇，置于圓底燒瓶中，加入20 mL乙醚，攪拌使溶解，再加入10 mL PBS溶液，超聲6 min得乳濁液，30℃旋轉(zhuǎn)至膠態(tài)，再加入AEE，35℃旋轉(zhuǎn)至干，加入PBS溶液、碎瓷片數(shù)枚，旋轉(zhuǎn)60 min，放置2 h使其充分水合，作為2號樣品。

2.3.3 乙醇注入法：同上稱取卵磷脂和膽固醇，置于小燒杯中，加入20 mL恒溫的95%乙醇，攪拌使溶解，再加入AEE，攪拌混勻，勻速注入55℃水浴恒溫的PBS溶液中，慢速攪拌10 min，水浴保溫50 min，放置2 h使其充分水合，作為3號樣品。

2.3.4 乙醚注入法：同上稱取卵磷脂和膽固醇，置于小燒杯中，加入20 mL乙醚，攪拌使溶解，加入AEE，攪拌搖勻，勻速注入55℃水浴恒溫的PBS溶液中，慢速攪拌10 min，水浴保溫50 min，放置2 h使其充分水合，作為4號樣品。

2.3.5 熔融法：同上稱取卵磷脂和膽固醇，分別置于燒杯中，加入10 mL恒溫的PBS液溶解卵磷脂后，倒入已熔化的膽固醇中，攪拌，再加入AEE，混勻后倒入55℃水浴恒溫的PBS溶液中，水浴放置50 min，放置2 h使其充分水合，作為5號樣品。

2.4 包封率的測定

將上述所得1～5號脂質(zhì)體溶液置冰水浴超聲處理10 min，0.8 μm濾膜過濾。精密吸取脂質(zhì)體濾液2 mL，于8000 r·min-1離心60 min，分取沉淀，用混合溶劑溶解并定容至10 mL，在516 nm波長處測定吸光度。同時，取未經(jīng)處理的AEE脂質(zhì)體混懸液2 mL，混合溶劑稀釋至10 mL，照“2.2.2”項(xiàng)下方法依法測定。照下式[6]計(jì)算包封率：包封率（%）＝系統(tǒng)中包封的藥量（A1）/系統(tǒng)中包封與未包封的總藥量（A2）×100%。所有樣品測定3次，取其平均值。包封率測定結(jié)果見表1。

表1 包封率測定結(jié)果（±s）Tab 1 Results of encapsulation efficiency（±s）

表1 包封率測定結(jié)果（±s）Tab 1 Results of encapsulation efficiency（±s）

3245包封率/%17.84±0.65樣品編號125.34±0.8348.39±0.4463.53±0.7150.62±0.71

由表1可知，以上方法中包封率的大小順序?yàn)橐掖甲⑷敕ǎ疽颐炎⑷敕ǎ灸嫦嗾舭l(fā)法＞薄膜分散法＞熔融法，即乙醇注入法制備的AEE脂質(zhì)體包封率最高。

2.5 AEE脂質(zhì)體形態(tài)結(jié)構(gòu)[7]觀察及粒徑大小分布

在室溫條件下，分別取上述1～5號脂質(zhì)體混懸液適量，加水稀釋，然后滴加在銅網(wǎng)上，使脂質(zhì)體在銅網(wǎng)上停留30 s，用濾紙吸去多余的液體，用1%醋酸雙氧鈾染液染色2 min，再用濾紙吸去多余液體，自然晾干后于透射電鏡下觀察并拍攝照片，測定粒徑，繪制粒徑分布圖。脂質(zhì)體粒子形態(tài)及粒徑分布見圖1。

圖1 脂質(zhì)體粒子形態(tài)及粒徑分布A.薄膜分散法；B.逆相蒸發(fā)法；C.乙醇注入法；D.乙醚注入法；E.熔融法；1.粒子形態(tài)；2.粒徑分布Fig 1 Morphology and particle size distribution of liposomeA.thin film dispersion method；B.reverse phase evaporation method；C.ethanol injection-extrude method；D.ether injection method；E.melting methods；1.particle morphology；2.particle size diatribution

由圖1可知，薄膜分散法、逆相蒸發(fā)法、乙醇注入法與乙醚注入法制得的脂質(zhì)體形態(tài)較完整，電鏡下為圓球狀或橢球狀的小囊泡，大小較均勻，其中乙醇注入法與乙醚注入法制得的脂質(zhì)體雙分子膜結(jié)構(gòu)清晰；從粒徑分布來看，均屬于單室脂質(zhì)體。熔融法未觀察到脂質(zhì)體，而呈現(xiàn)AEE的結(jié)晶顆粒。

2.6 穩(wěn)定性考察

取包封率最高的乙醇注入法制得的脂質(zhì)體進(jìn)行考察。

2.6.1 貯藏條件：將AEE脂質(zhì)體液分別于冰箱（4℃）和室溫（20～25℃）放置1周，測定其包封率。結(jié)果，7 d后冰箱和室溫貯藏的包封率分別為51.86%和48.35%，因此該脂質(zhì)體適宜于4℃貯藏。

2.6.2 滲漏率：將制得的脂質(zhì)體于當(dāng)日測定包封率后不同條件（4℃和室溫）貯藏1周，然后再測定包封率，按下式計(jì)算滲漏率：滲漏率＝（當(dāng)日測得的包封率－定期測定的包封率）/當(dāng)日測得的包封率×100%。結(jié)果，當(dāng)日的包封率為54.67%，7 d后4℃和室溫貯存的滲漏率分別為2.81%和6.32%。

3 討論

本研究對AEE脂質(zhì)體的制備方法進(jìn)行了篩選，比較了薄膜分散法、逆相蒸發(fā)法、乙醇注入法、乙醚注入法及熔融法制備的脂質(zhì)體的包封率、形態(tài)及粒徑大小分布。結(jié)果，除熔融法外，均可得到形態(tài)較完整、粒徑分布符合要求的脂質(zhì)體。但薄膜分散法和逆相蒸發(fā)法制得的脂質(zhì)體包封率較低，乙醚注入法中乙醚有一定的毒性。因此綜合考慮各種因素，認(rèn)為乙醇注入法適用于AEE脂質(zhì)體的制備。乙醇注入法制備AEE脂質(zhì)體的優(yōu)化工藝有待于進(jìn)一步研究。

影響脂質(zhì)體形成、包封率、粒徑大小、穩(wěn)定性的因素較多。研究發(fā)現(xiàn)，在薄膜分散法和逆相蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體時，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑成膜時，應(yīng)以較快的速度旋轉(zhuǎn)使之形成薄而均勻的膜，且不能完全旋干。在加入PBS液后，應(yīng)用較慢的速度旋轉(zhuǎn)，使其充分水合，有利于脂質(zhì)體的形成。外水相的用量影響脂質(zhì)體的包封率，隨著PBS量的增大，包封率呈下降趨勢?？赡苡捎谟袡C(jī)相在外水相中的比例擴(kuò)大后，溶液稀釋，脂質(zhì)體內(nèi)部被包封的藥物易向外滲漏。脂質(zhì)體在制備的最后階段應(yīng)放置一定時間，使其充分溶脹，便于水合形成脂質(zhì)體。經(jīng)過多次試驗(yàn)考察，認(rèn)為放置2 h比較合適。超聲可以改變脂質(zhì)體的粒徑，將大多室脂質(zhì)體轉(zhuǎn)變?yōu)樾问抑|(zhì)體。冰水浴超聲時間的長短對包封率和載藥量均有不同程度的影響，超聲時間越長，吸附藥量越多，但時間過長會破壞脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。通過試驗(yàn)驗(yàn)證，選定10 min較適宜。

經(jīng)過對AEE脂質(zhì)體的滲漏率測定，結(jié)果顯示脂質(zhì)體的滲漏率與存放溫度有很大關(guān)系，在4℃存放時，滲漏率較低，可有效地降低脂質(zhì)體的“突釋效應(yīng)”。

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[3]楊曉笛，盧 鋒，黃美充，等.中藥紫草有效成分的提取[J].汕頭大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，17（4）：67.

[4]席 萍，吳 敏，孫亦群.現(xiàn)代試驗(yàn)技術(shù)與方法在藥物透皮吸收研究中的應(yīng)用[J].中國藥房，2002，13（5）：304.

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