楊宏莉，張宏馨，王燕，李蘭會，崔杰，王桂珍，曲靜

（1.河北大學醫(yī)學部，保定市 071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，保定市 071000；3.河北景縣人民醫(yī)院，衡水市 053500；4.北京市第三社會福利院，北京市 100089；5.河北省榮軍醫(yī)院，保定市 071000）

山藥多糖是從山藥塊莖中提取的一種有效成分。有研究證實，山藥多糖具有多種藥理作用，如降血糖、抗衰老、增強免疫功能、抗突變、抗腫瘤、抗氧化作用等[1～5]。對于山藥多糖的降血糖作用，國內(nèi)外的研究僅停留在其有降低血糖和刺激胰島素分泌的層面[6，7]，對于其具體的降糖機制的研究尚無文獻報道。本課題組曾經(jīng)考察了山藥多糖對2型糖尿病大鼠血糖、肌肉己糖激酶（HK）、線粒體琥珀酸脫氧酶（SDH）和肝臟蘋果酸脫氫酶（MDH）活性的影響。在此基礎(chǔ)上，本研究旨在探討山藥多糖改善2型糖尿病大鼠的作用機制，觀察山藥多糖對2型糖尿病鼠腎組織內(nèi)胰島素受體底物1（IRS-1）蛋白表達和磷酯酰肌醇3激酶（PI-3K）水平的影響。

1 材料

1.1 儀器

TP-5000A型電子天平（湘儀天平儀器設(shè)備有限公司）；GT-1640型京都血糖儀、試紙（日本Arkray公司）；SN-682型放射免疫γ計數(shù)器（上海核福光電儀器有限公司）；RM2135型切片機（德國Leica公司）；CX40型顯微鏡（日本Olympus公司）；BI-2000型圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 試藥

山藥多糖溶液（從懷山藥中提取制成粉劑，總糖含量91.2%，臨用前用生理鹽水新鮮配制）；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；血清胰島素放射免疫測定試劑盒（天津九鼎醫(yī)學生物工程有限公司）；鼠IRS-1單克隆抗體、兔PI-3K多克隆抗體（美國Neomarkers公司）；兔胰島素受體（InsR）多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；SP試劑盒（北京中山生物技術(shù)公司）；鹽酸二甲雙胍片（北京市永康藥業(yè)有限公司）。

1.3 動物

清潔級健康Wistar大鼠60只，♂，體質(zhì)量（180±20）g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供（動物合格證號：604104）。

2 方法與結(jié)果

2.1 分組及給藥

實驗分為6組，即正常對照（等體積蒸餾水）、模型（等體積蒸餾水）、二甲雙胍（100 mg·kg-1）及山藥多糖高、中、低劑量（100、70、40 mg·kg-1）組。ig 給藥，每天1次，連續(xù)4周。

2.2 模型復(fù)制

健康雄性的Wistar大鼠，先于溫度25℃、相對濕度50%～60%室內(nèi)適應(yīng)性1周。給予高熱量飼料8周后，一次性尾iv小劑量35 mg·kg-1STZ（STZ用0.1 mol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉溶液（pH 4.0）稀釋成1%的溶液），注射72 h后測定空腹血糖穩(wěn)定在13.5 mmol·L-1以上者為復(fù)制成功模型。

2.3 樣本采集

ig結(jié)束后大鼠禁食過夜，取血清檢測血清胰島素及胰高血糖素；然后采用斷頸法處死動物，處死前15 min均ip普通胰島素10 IU·kg-1，以誘發(fā)信號傳導通路。迅速打開腹腔取腎組織，將標本剪成1 mm×1 mm大小的組織塊，置于4%多聚甲醛溶液固定，用于免疫組化染色。

2.4 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件包進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s 表示；組間計量資料差異性比較采用t檢驗。P＜0.05為差別有統(tǒng)計學意義。

2.5 山藥多糖對模型大鼠血清胰島素及胰高血糖素的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠血清胰島素水平顯著降低（P＜0.01），而胰高血糖素水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，山藥多糖高、中、低劑量組大鼠胰島素水平顯著升高（P＜0.01），而胰高血糖素水平顯著降低（P＜0.01）。血清胰島素及胰高血糖素的測定采用放射免疫法，嚴格按照試劑盒說明書進行。山藥多糖對模型大鼠血清胰島素及胰高血糖素的影響見表1。

表1 山藥多糖對2型糖尿病大鼠血清胰島素及胰高血糖素的影響（±s）Tab 1 Effect of polysaccharides from D.opposita on serum insulin and glucagon in rats with type 2 diabetes mellitus（±s）

表1 山藥多糖對2型糖尿病大鼠血清胰島素及胰高血糖素的影響（±s）Tab 1 Effect of polysaccharides from D.opposita on serum insulin and glucagon in rats with type 2 diabetes mellitus（±s）

與正常對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.01

組別正常對照組模型組山藥多糖低劑量組山藥多糖中劑量組山藥多糖高劑量組二甲雙胍組胰高血糖素/ρg·mL-1 300.86±54.32438.74±61.73＊341.42±60.13#338.75±49.98#336.51±53.42#450.14±57.69 n 101010101010胰島素/pmol·L-1 48.65±10.7625.61±7.14＊41.45±13.26#40.51±12.47#44.26±11.82#24.21±16.78

2.6 山藥多糖對InsR、IRS-1蛋白表達和PI-3K水平的影響

取4%多聚甲醛固定后的腎組織小塊，常規(guī)石蠟包埋，切片。免疫組化染色采用SP法，具體步驟：加1滴過氧化酶阻斷溶液，室溫孵育10 min，PBS（pH 7.4）沖洗3次，每次3 min；加1滴非免疫性動物血清，室溫孵育5 min，PBS（pH 7.4）沖洗1次；加1滴1抗，4 ℃過夜，PBS（pH 7.4）沖洗3次，每次3 min；加1滴生物素標記的2抗，室溫孵育10 min，PBS（pH 7.4）沖洗3次，每次3 min；加1滴鏈親和素-過氧化物溶液，室溫孵育10 min，PBS（pH 7.4）沖洗3次，每次3 min；加1滴新制備的二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液，室溫孵育3 min；蘇木素復(fù)染，酒精脫水，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

免疫組化染色后，大鼠腎組織出現(xiàn)棕黃色物質(zhì)為陽性。正常對照組腎組織InsR、IRS-1、PI-3K染色均分布于腎小管上皮細胞胞漿中，著色強；模型組InsR、IRS-1、PI-3K上述部位染色均較正常對照組減弱；山藥多糖高、中、低劑量組InsR、IRS-1、PI-3K上述部位染色均較模型組有明顯增強。山藥多糖對2型糖尿病大鼠腎組織InsR、IRS-1、PI-3K表達的影響見表2。

表2 山藥多糖對2型糖尿病大鼠腎組織InsR、IRS-1、PI-3K表達的影響（±s）Tab 2 Effect of polysaccharides from D.opposita on the expression of InsR，IRS-1 and Pl-3K of renal tissue in rats with type 2 diabetes mellitus（±s）

表2 山藥多糖對2型糖尿病大鼠腎組織InsR、IRS-1、PI-3K表達的影響（±s）Tab 2 Effect of polysaccharides from D.opposita on the expression of InsR，IRS-1 and Pl-3K of renal tissue in rats with type 2 diabetes mellitus（±s）

與正常對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.01

組別正常對照組模型組山藥多糖低劑量組山藥多糖中劑量組山藥多糖高劑量組二甲雙胍組Pl-3K 0.2548±0.039100.2231±0.02675＊0.2499±0.0243#0.2512±0.02609#0.2545±0.03017#0.2081±0.01679 n 101010101010 InsR 0.1708±0.024370.1478±0.01986＊0.1691±0.02142#0.1698±0.01784#0.1702±0.01943#0.1398±0.01824 IRS-10.1710±0.023750.1469±0.01743＊0.1699±0.01768#0.1701±0.01945#0.1702±0.02001#0.1388±0.01694

3 討論

目前，2型糖尿病是世界上危害人類健康的主要疾病之一。2型糖尿病的形成機制很復(fù)雜，目前認為糖尿病是遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果；而胰島素信號傳導是導致糖尿病形成的重要環(huán)節(jié)。2型糖尿病信號傳導可以發(fā)生在受體前水平、受體水平及受體后水平3個層次，以受體后水平的變化最為常見[8]。

從治療藥物來看，降血糖西藥作用強、起效快，但往往缺乏整體的協(xié)調(diào)性，不利于糖尿病患者長期使用。中醫(yī)藥治療糖尿病從整體調(diào)節(jié)入手，不良反應(yīng)少，且可改善臨床癥狀，有效防止并發(fā)癥產(chǎn)生[9]。因此，本研究采用高熱量飲食并結(jié)合低劑量STZ ip的方法復(fù)制2型糖尿病模型，在對此2型糖尿病大鼠ig不同劑量的山藥多糖（40、70、100 mg·kg-1）后，檢測血清中胰島素和胰高血糖素；同時，取大鼠腎組織通過免疫組化法檢測InsR、IRS-1蛋白表達和PI-3K水平的變化。

血清中胰島素和胰高血糖素水平的變化結(jié)果表明，山藥多糖具有保護和修復(fù)胰島細胞的作用，同時能夠降低血清中胰高血糖素水平，抑制糖尿病可能的發(fā)病機制[10，11]，而且其效果優(yōu)于純西藥降糖制劑。同時，山藥多糖提高了糖尿病模型大鼠腎組織InsR、IRS-1和PI-3K水平，增強了PI-3K信號傳導通路，增加了組織對胰島素的敏感性，改善了胰島素信號傳導。

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