歸芍清血合劑由生地黃、赤芍、當(dāng)歸、金銀花、黃芩等九味中藥組成。本品清熱解毒,涼血止痛,臨床用于皮膚過敏、瘙癢等癥。為有效地控制制劑質(zhì)量,本實(shí)驗(yàn)建立了赤芍、當(dāng)歸、金銀花、黃芩的薄層色譜鑒別方法,并采用HPLC法測定君藥赤芍的主要成分芍藥苷的含量。
Agilent 1100高效液相色譜儀,Agilent 紫外檢測器,Agilent色譜化學(xué)工作站;Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。XS-104型分析天平(瑞士梅特勒);芍藥苷對照品(中國藥品生物制品檢定所,110736-200527),阿魏酸對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號110773-200611),綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號110753-200413), 黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號110708-200205);歸芍清血合劑及陰性對照品(本院自制);甲醇、乙腈為色譜純,其他試劑為分析純,水為注射用水。
2.1.1 當(dāng)歸的薄層鑒別 取本品20ml,加乙醚振搖提取2次,每次20ml,合并乙醚液(水液備用),揮干,殘渣加乙酸乙酯1ml使溶解,作為供試品溶液。另取阿魏酸對照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作為對照品溶液。再取不含當(dāng)歸的空白樣品,按供試品溶液制備法制成陰性樣品溶液。分別吸取上述三種溶液各5 μl, 點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷- 乙酸乙酯-甲酸(25∶12∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對照色譜相應(yīng)的位置上,顯相同的藍(lán)色熒光斑點(diǎn),陰性無干擾。
2.1.2 赤芍的薄層鑒別 取“2.1.1”項(xiàng)下乙醚提取后的水液,用水飽和的正丁醇振搖提取2次,正丁醇液蒸干,殘渣加乙醇1 ml使溶解,作為供試品溶液。另取芍藥苷對照品,加乙醇制成每1 ml含2 mg的溶液,作為對照品溶液。再取不含赤芍的空白樣品,按供試品溶液制備法制成陰性樣品溶液。分別吸取上述三種溶液各5μl, 點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以5%香草醛硫酸溶液,熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)清晰。供試品溶液色譜中,在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn),陰性無干擾。
2.1.3 金銀花的薄層鑒別 取本品20 ml,用乙酸乙酯振搖提取2次,每次20 ml,合并提取液,濃縮至0.5 ml,作為供試品溶液。另取綠原酸對照品,加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液,作為對照品溶液。再取不含金銀花的空白樣品,按供試品溶液制備法制成陰性樣品溶液。分別吸取上述三種溶液各10 μl,點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以乙酸丁酯-甲酸-水(14∶5∶5)的上層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,在紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn),陰性無干擾。
2.1.4 黃芩的薄層鑒別 取本品10 ml,加稀鹽酸2滴,用乙酸乙酯提取2次,每次10 ml,合并提取液,蒸干,殘渣加甲醇1 ml使溶解,作為供試品溶液。另取黃芩苷對照品,加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液,作為對照品溶液。再取不含黃芩的空白樣品,按供試品溶液制備法制成陰性樣品溶液。分別吸取上述三種溶液各5 μl,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以2%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中,在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn),陰性無干擾。
2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性考察 色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:乙腈-水(20∶80),檢測波長230 nm,柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20 μl。在此色譜條件下,供試品及對照品溶液在相同保留時間處有吸收峰,而陰性對照溶液在相應(yīng)位置無吸收峰,陰性對照品對檢測無干擾,理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計不低于10000。見圖5~7。
2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷對照品2.4 mg,置10 ml量瓶中,加甲醇使溶解并稀釋至刻度,搖勻。取此液加甲醇稀釋成含芍藥苷0.024 g·L-1的溶液, 作為對照品溶液。
2.2.3 供試品溶液及陰性對照溶液的制備 精密量取本品2 ml,置50 ml量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,取上清液,濾過,精密吸取續(xù)濾液2 ml, 置10 ml量瓶中,加流動相稀釋至刻度,作為供試品溶液;取按處方量除去赤芍制成的陰性對照品,依照供試品溶液的制備方法所得溶液為陰性對照溶液。
2.2.4 線性關(guān)系考察 取0.24 g·L-1的芍藥苷溶液,依次加甲醇稀釋為0.024、0.016、0.008、0.004、0.002 g·L-1的溶液,各取20 μl分別進(jìn)樣,以芍藥苷進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),計算得回歸方程y=2079.8897x+5.1831,r=0.9994。
結(jié)果表明,芍藥苷進(jìn)樣量在0.04~0.48 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。
圖1 當(dāng)歸薄層鑒別色譜圖
圖2 赤芍薄層鑒別色譜圖
圖3 金銀花薄層鑒別色譜圖
圖4 黃芩薄層鑒別色譜圖
2.2.5 精密度試驗(yàn) 供試品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,每次進(jìn)樣20 μl, 按上述色譜條件測定峰面積,計算RSD為0.65%。
2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液,室溫避光保存,分別于配制后0,2,4,8,12,24小時進(jìn)樣20 μl測定計算,結(jié)果RSD為0.78。
2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批樣品(070801)6份,分別按樣品測定方法測定,計算樣品中芍藥苷的平均含量為0.797 mg·ml-1,RSD為1.02%。
2.2.8 回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的樣品溶液(批號 070801)6份各1.0 ml,置50 ml量瓶中,分別精密加入0.32 g·L-1的芍藥苷對照品溶液2.0,2.0,2.5,2.5,3.0,3.0 ml,按“2.2.3”項(xiàng)下的方法制備,在上述色譜條件下測定,計算回收率,結(jié)果見表1。
圖5 芍藥苷對照品
圖6 樣品
圖7 陰性對照
表1回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)
樣品含量(mg)加入量(mg)測得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)0.7970.641.40494.840.7970.641.43199.060.7970.801.56796.2597.131.180.7970.801.57397.000.7970.961.74498.650.7970.961.72896.98
表2 樣品測定結(jié)果
2.2.9 樣品測定 取歸芍清血合劑樣品3批,按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的方法制備后分別進(jìn)樣3次,計算,結(jié)果見表2。
薄層鑒別參考有關(guān)文獻(xiàn)[1-2],赤芍經(jīng)水飽和的正丁醇提取后,薄層色譜斑點(diǎn)較清晰;樣品溶液經(jīng)鹽酸處理后用有機(jī)溶劑提取,鑒別黃芩苷,方法簡便,重現(xiàn)性好。
赤芍有清熱涼血作用,為方中主要成分,因此選擇芍藥苷作為含量測定指標(biāo),參考有關(guān)文獻(xiàn)[3-6],分別以甲醇和稀乙醇提取樣品,結(jié)果以甲醇超聲提取30分鐘結(jié)果最好,因此選擇甲醇為提取溶劑。
本文建立的薄層鑒別和含量測定方法簡便、準(zhǔn)確,重復(fù)性好,為歸芍清血合劑的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。
[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:422,585.
[2]呂武清,龍新華.中成藥中的藥材薄層色譜鑒別[M].北京:人民衛(wèi)生出版社.1997:291,464.
[3]趙鐵,李玉靈,阮國虎,等.HPLC法測定赤丹丸中芍藥苷的含量[J].中國藥師,2007,10(4):326-327.
[4]胡雙豐.高效液相色譜法測定八珍顆粒中芍藥苷含量研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志,2005,22(6):492-493.
[5]遲強(qiáng),欒中山.HPLC測定暖胃舒樂片中芍藥苷含量[J].中成藥,2007,29(1):附3-5.
[6]呂永寧,張玉良,徐楚鴻,等.反相高效液相色譜法測定疹癢康合劑中芍藥苷的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2004,23(5):336-337.