牛 娜 鄭晨光 張魯剛 胥宇建 張立志 付文婷

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，農(nóng)業(yè)部西北園藝植物種質(zhì)資源利用重點開放實驗室，陜西 楊凌 712100）

大白菜〔Brassica campestris L.ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕屬十字花科蕓薹屬，原產(chǎn)于中國，栽培歷史悠久，是蕓薹屬植物中具有較高經(jīng)濟價值、營養(yǎng)價值和研究價值的重要葉菜類作物之一。大白菜不僅在我國有著廣泛的分布和栽培，而且在日本、朝鮮、韓國及南亞國家也有著廣泛的栽培。大白菜結(jié)球性狀直接關(guān)系到大白菜的產(chǎn)量和商品性，特別是早熟大白菜，一旦裂球，基本上失去商品價值。因此，提高大白菜的耐裂球性是大白菜育種的一個重要目標(biāo)，但有關(guān)大白菜裂球方面的研究國內(nèi)外尚未見報道。而在同屬蕓薹屬的甘藍(lán)作物上已有一些研究，主要集中在甘藍(lán)裂球性的解剖學(xué)特征（王麗娟和秦智偉，1994）、性狀的配合力和遺傳力（莊木 等，2009）、內(nèi)源激素的含量與裂球性的關(guān)系（曾愛松 等，2009）以及栽培因子對裂球性的影響（秦智偉 等，1994）等方面，尚未見分子標(biāo)記方面的報道。

本試驗以大白菜分離群體為試材，從建立大白菜裂球性狀的分級標(biāo)準(zhǔn)入手，在分析大白菜裂球性狀遺傳規(guī)律的基礎(chǔ)上，篩選與裂球基因連鎖的分子標(biāo)記，以期為耐裂球性大白菜品種選育和分子標(biāo)記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試2套大白菜材料F1均有裂球現(xiàn)象，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院大白菜課題組提供。

材料A：親本分別為自交不親和系06J31和自交系92S24，雙親正反交F1，F(xiàn)2為06J31×92S24的單株自交群體。06J31葉淺綠色，葉球疊抱，近圓球形，葉球高12 cm，球?qū)?0.5 cm，生育期50～55 d；92S24葉綠色，葉球疊抱，倒卵形，生育期55～60d。F1葉球頭球形，疊抱，結(jié)球極緊實，腋芽不發(fā)達(dá)，葉球高22.8 cm，球?qū)?4.2 cm。

材料B：親本分別為自交不親和系06J31和05S50，雙親正反交F1，F(xiàn)2為06J31×05S50的單株自交群體。05S50株型小而緊湊，葉球高15 cm，球?qū)?2 cm，外葉深綠，葉球疊抱，生育期50～55 d。F1葉球頭球形，疊抱，結(jié)球極緊實，腋芽不發(fā)達(dá)，葉球高17 cm，球?qū)?2 cm。

親本材料結(jié)球松散，緊實度較低，正常情況下不表現(xiàn)裂球性。

1.2 方法

試驗材料B、A分別于2008年8月5、10日大田播種育苗，育苗期間按常規(guī)管理（鈕心恪，1984）。材料B于8月24日定植，材料A于9月2日定植。大田定植后，單株編號，葉球成熟期連續(xù)觀察葉球變化。以材料A的F2群體為材料，進行RAPD分子標(biāo)記研究。

1.2.1 F2群體裂球基準(zhǔn)時期及最佳分析時期的確定 以F1群體的成熟期（80%植株葉球達(dá)到緊實時的天數(shù)）作為F2群體裂球記載的基準(zhǔn)時期，在此基礎(chǔ)上延遲生育期，每隔5 d觀察1次裂球性狀，至群體裂球率不再變化為止。分析群體裂球植株增加速率，統(tǒng)計裂球率。

1.2.2 裂球性狀分級標(biāo)準(zhǔn)的確定及遺傳規(guī)律分析 從裂球基準(zhǔn)時期開始，連續(xù)觀察大白菜葉球開裂變化情況，分析裂球變化的范圍，確立了裂球性狀分級標(biāo)準(zhǔn)。

零級：葉球無裂葉；一級：葉球有1～3片葉裂；二級：葉球有4～5片葉裂，且葉球裂縫深度/葉球縱經(jīng)≤0.2；三級：0.2<葉球裂縫長度/葉球橫徑≤0.4，0.2<葉球裂縫面積/葉球表面積≤0.4，0.2<葉球裂縫深度/葉球縱徑≤0.3；四級：0.4<葉球裂縫長度/葉球橫徑≤0.7，0.4<葉球裂縫面積/葉球表面積≤0.6，0.3<葉球裂縫深度/葉球縱徑≤0.5；五級：葉球裂縫長度/葉球橫徑＞0.7，葉球裂縫面積/葉球表面積＞0.6，葉球裂縫深度/葉球縱徑＞0.5。

按照上述裂球性狀分級標(biāo)準(zhǔn)完成田間調(diào)查后，參照孟德爾遺傳規(guī)律進行初步分析，并進行適合性檢驗。數(shù)據(jù)采用DPS軟件進行統(tǒng)計分析（唐啟義和馮明光，2002）。

1.2.3 模板DNA提取 親本、F1及F2單株的基因組DNA提取采用李永明和趙玉琪（2001）的方法，并參照王綺等（2006）方法，稍有改動。操作方法的改進點：取0.2 g幼嫩葉片裝入1.5 mL離心管中，在盛有液氮的容器中預(yù)冷，取出時離心管中留一點兒液氮，然后迅速研磨成粉末。

1.2.4 RAPD擴增 采用25 μL反應(yīng)體系，包括1×緩沖液，2.5 mmol·L-1MgCl2，0.2 mmol·L-1dNTPs，0.3 μmol·L-1引物，Taq DNA聚合酶1 U，模板DNA 20ng。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，36 ℃退火1 min，72 ℃延伸90s，45個循環(huán)，72 ℃延伸10min。最后在1.5 %瓊脂糖凝膠上電泳分離，電泳緩沖液為1×TAE，電泳后先在EB中染色，然后在紫外燈下觀察并照相。隨機引物購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，Taq聚合酶購自寶生物（大連）有限公司，DNA Marker購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2.5 DNA混合池建立及引物篩選 根據(jù)田間調(diào)查結(jié)果，在F2分離群體中隨機抽取零級（即不裂）和裂球程度較高的四至五級植株各10株，分別等量混合各單株DNA，構(gòu)建裂球和不裂球DNA池，以兩個DNA池為模板，采用BSA法（Ajisaka et al.，2001）進行RAPD引物篩選。為了使所得標(biāo)記更加準(zhǔn)確，不受環(huán)境等條件影響，選取早期裂球的植株。

1.2.6 遺傳連鎖分析 應(yīng)用JoinMap 3.0軟件計算遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 裂球性狀統(tǒng)計基準(zhǔn)時期和最佳分析時期的確定

材料 A、材料 B的 F2群體分別在定植后75 d和60d有80%葉球達(dá)到緊實，作為裂球情況統(tǒng)計的基準(zhǔn)時期。對2套材料田間調(diào)查統(tǒng)計分析表明，大白菜裂球的多少受延長生育期天數(shù)的影響明顯（圖1），至大白菜植株幾乎不再生長為止（一般為延長生育期 30～35 d），裂球株數(shù)隨著生育期的延長而增多，這樣很難分析裂球性狀。為了明確其遺傳規(guī)律，需要確定一個相對最佳時期來分析該性狀。

從圖1可以看出，2套材料F2群體單株的裂球發(fā)生規(guī)律基本一致，在延長生育期20d時可以看作裂球發(fā)生的臨界期，此時裂球株數(shù)集中出現(xiàn)，形成裂球發(fā)生高峰，累計裂球株數(shù)約占總裂球株數(shù)的80%；此后裂球率日趨降低，至延長生育期30d以后，群體裂球株數(shù)幾乎不再發(fā)生。因此，可將延長生育期20d作為裂球性狀分析的最佳時期。

圖1 F2群體裂球率的動態(tài)變化

2.2 正反交F1裂球期方差分析

在最佳分析時期，材料A正反交F1裂球率分別為26.3 %、31.5 %，材料B正反交F1裂球率分別為33.3 %、25.0%。

由表1可見，2套材料正反交組合間差異均不顯著，這說明大白菜裂球性狀是受核基因控制的，與細(xì)胞質(zhì)遺傳無關(guān)。

2.3 F2群體裂球性狀遺傳分析

分析2套材料在F2延長生育期20d時裂球性狀的分離情況，發(fā)現(xiàn)2套材料均在延長生育期20d時不裂球株數(shù)與裂球株數(shù)的分離比例（不裂球∶裂球）接近3∶1，因此初步認(rèn)為該性狀可能受1對主效基因控制。

對2套材料F2群體裂球性進行χ2測驗（表2），結(jié)果表明：延長生育期20d時，χ2值均<，符合3∶1的分離比例；由于材料A較材料B定植晚、生育期長，材料A延長生育期20～25 d和材料B延長生育期10～20d的不裂球與裂球的分離比例均符合3∶1的比例，2套材料所表現(xiàn)的這種時間差異，除了與材料本身（遺傳因素）有關(guān)外，可能與生長期的環(huán)境條件尤其是溫度也有很大的關(guān)系。

表1 F1裂球期的方差分析

上述分析表明大白菜裂球性狀至少受1對主基因控制，同時還受到微效基因和環(huán)境條件的影響。

表2 大白菜F2裂球性狀田間觀察結(jié)果

2.4 RAPD引物篩選及標(biāo)記分析

用本實驗室保存的600個RAPD引物對裂球和不裂球DNA池進行擴增，不同引物擴增的條帶數(shù)目為0～11條譜帶，擴增片段大小為100～2000bp，有483個引物擴增出穩(wěn)定而清晰的條帶，其中只有87個引物在兩池之間的擴增條帶存在差異，表現(xiàn)出遺傳多態(tài)性。

在87個引物中，表現(xiàn)出明顯擴增多態(tài)性的引物有34個，占總引物的5.7 %。經(jīng)3次以上重復(fù)篩選，有15個引物在兩池間都表現(xiàn)出較好的多態(tài)性。經(jīng)親本、F1及F2驗證，僅有1個引物S15在不裂球池內(nèi)擴增出相同大小且清晰的特異條帶（圖2）。

圖2 引物S15對親本、F1和F2的PCR擴增結(jié)果

對材料A的148個F2單株DNA用S15進行PCR擴增，有110個單株擴增出與親本06J31相同的條帶，38株未擴增出此特異條帶，特異條帶為222 bp。特異條帶有/無（110/38）比率的卡方測驗χ2值為 0.036（<=3.84），符合3∶1分離比例。認(rèn)為該標(biāo)記是與控制大白菜裂球性狀的主效基因相關(guān)的RAPD標(biāo)記。發(fā)生交換的植株有13株，交換率為8.784 %。應(yīng)用JoinMap 3.0軟件計算，該標(biāo)記與裂球基因間的遺傳距離為8.876 cM。

3 結(jié)論與討論

3.1 關(guān)于裂球標(biāo)準(zhǔn)的劃分

研究裂球性首先要進行裂球性狀的判斷與分級，大白菜裂球多以葉球開裂為主，但也有根裂現(xiàn)象的發(fā)生。實際生產(chǎn)中，大白菜葉球開裂的方式可以分為橫裂、縱裂、混合裂和不規(guī)則裂等。因此，用單一指標(biāo)難以準(zhǔn)確評價單株裂球性，本試驗采用葉球三維綜合指標(biāo)進行大白菜裂球性狀的分級。該分級標(biāo)準(zhǔn)簡單明了、且易于掌握，尤其方便田間調(diào)查使用，但由于試材有限，該分級標(biāo)準(zhǔn)比較粗，可在今后的研究中不斷細(xì)化、完善。

本試驗發(fā)現(xiàn)大白菜葉球開裂多發(fā)生在結(jié)球后期，裂球初始階段發(fā)生裂球的植株少、葉球開裂程度低且變化緩慢，而在葉球成熟后期裂球植株逐漸增多、開裂速度加快。因此在分級標(biāo)準(zhǔn)劃分時，裂球程度低的級別間級差小，以后逐漸增大，較高的裂球級別之間級差較大，使分級標(biāo)準(zhǔn)更加準(zhǔn)確，為大白菜裂球程度的劃分提供依據(jù)。

3.2 關(guān)于大白菜裂球性狀的遺傳規(guī)律

在傳統(tǒng)的自交系選育中沒有有意識地進行裂球性的選擇，因此經(jīng)濟性狀一致的自交系其控制裂球性的相關(guān)基因位點是隨機的，如果雙親帶有裂球基因，其配制的雜交一代就可能出現(xiàn)裂球植株，這不能簡單的用顯隱性解釋。鑒于大白菜裂球現(xiàn)象的遺傳復(fù)雜，本試驗利用的是單株自交的F2群體，這可以消除親本裂球性基因位點不純合帶來的遺傳復(fù)雜性，取得相對準(zhǔn)確的結(jié)果。

本試驗通過對兩套分離群體的調(diào)查分析認(rèn)為大白菜裂球性狀為質(zhì)量-數(shù)量性狀（莫惠棟，1993），耐裂球為顯性，至少有1對主基因控制其性狀的表現(xiàn)，同時還受到微效基因和環(huán)境條件的共同影響。這與秦智偉等（1994）認(rèn)為甘藍(lán)裂球性主要由遺傳因素引起的研究結(jié)果相似。本試驗使用的材料腋芽不發(fā)達(dá)，裂球的原因主要是內(nèi)葉不斷生長導(dǎo)致外葉斷裂，其遺傳規(guī)律反映了內(nèi)葉生長和外葉韌度兩方面的特性，具體以那一方為主尚不能確定，另外在實踐中也?？吹接行┮秆堪l(fā)達(dá)的大白菜品種容易裂球，這種情況與內(nèi)葉生長關(guān)系不大，其與本試驗材料可能屬于不同的裂球類型，但尚無相關(guān)報道。

3.3 大白菜裂球性狀最佳分析時期的確定

大白菜裂球性狀為質(zhì)量-數(shù)量性狀，裂球率隨著生育期延長而變化，因此確定適宜的統(tǒng)計時期十分重要，本試驗以形成裂球發(fā)生高峰的時期作為該性狀的最佳分析時期比較符合實際，分階段統(tǒng)計分離比例表明此時的分離比例接近孟德爾遺傳規(guī)律分離比例，也有利于主效基因的發(fā)現(xiàn)與分子標(biāo)記研究，本試驗是可行的。

3.4 大白菜裂球性狀的分子標(biāo)記

本試驗以材料A的F2群體為材料，找到了與裂球基因緊密連鎖的RAPD分子標(biāo)記S15-222，其與裂球基因的遺傳距離為8.876 cM，由于裂球性狀也不同程度地受溫度、水分等環(huán)境條件的影響，所以，因環(huán)境作用而表現(xiàn)為裂球的不裂球單株則不屬于發(fā)生交換的范疇。因此，可以推測S15-222與裂球基因間的遺傳距離≤8.876 cM，因此該標(biāo)記可以有效地應(yīng)用到大白菜裂球性狀的分子標(biāo)記輔助育種中，而且該標(biāo)記是否適合材料B，還有待于驗證。

李永明，趙玉琪.2001.實用分子生物學(xué)方法手冊.北京：科學(xué)出版社：173-178.

莫惠棟.1993.質(zhì)量一數(shù)量性狀的遺傳分析：I.遺傳組成和主基因基因型鑒別.作物學(xué)報，19（1）：1-6.

鈕心恪.1984.大白菜抗霜霉病，病毒病原始材料的篩選及抗性遺傳的研究.中國蔬菜，（4）：28-32.

秦智偉，王麗娟，王超，許蕊仙.1994.甘藍(lán)（Brassica oleracea var.capitata）裂球性研究Ⅰ.品種施肥及采收期對甘藍(lán)裂球的影響.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，25（4）：344-346.

唐啟義，馮明光.2002.實用統(tǒng)計分析及DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng).北京：科學(xué)出版社.

王麗娟，秦智偉.1994.春甘藍(lán)裂球性的解剖特征//中國園藝學(xué)會.中國園藝學(xué)會首屆青年學(xué)術(shù)討論會論文集.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社：581-582.

王綺，張魯剛，張戰(zhàn)鳳，惠麥俠，張明科.2006.白菜雜交種‘冠春’雜交率的RAPD分析.西北植物學(xué)報，26（4）：677-682.

莊木，張揚勇，方智遠(yuǎn)，劉玉梅，楊麗梅，孫培田.2009.結(jié)球甘藍(lán)耐裂球性狀的配合力及遺傳力研究.中國蔬菜，（2）：12-15.

曾愛松，劉玉梅，方智遠(yuǎn)，楊麗梅，莊木，張揚勇，孫繼峰，孫培田.2009.甘藍(lán)結(jié)球過程中內(nèi)源激素含量與裂球性的關(guān)系.中國蔬菜，（20）：11-16.

Ajisaka H，Kuginuki Y，Yui S，Enomoto S，Hirai M.2001.Identification and mapping of a quantitative trait locus controlling extreme late bolting in Chinese cabbage（Brassica rapa L.ssp.pekinensis syn.campestris L.）using bulked segregant analysis.Euphytica，118（1）：75-81.