郭 明 張 賀 李景富

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

葉色突變是自然界比較常見的一種突變，由于突變基因往往是直接或間接影響葉綠素的合成和降解，改變?nèi)~綠素含量，所以葉色突變體也稱為葉綠素突變體（何冰 等，2006）。對(duì)葉色突變的研究開始得較早，在20世紀(jì)30年代就有報(bào)道，在水稻（吳殿星 等，1997）、大豆（Honeycutt et al.，1990；馬國(guó)榮 等，1994）、大麥（史俊通 等，1998）、小麥（蘇小靜 等，1990）、棉花（肖松華 等，1995）、西瓜（Whitaker，1952）等多種作物中獲得了此類突變體。研究表明，葉色突變體作為一種特殊的材料，對(duì)研究高等植物的光合機(jī)理（Fambrini et al.，2004）、葉綠素的生物合成、葉綠體的結(jié)構(gòu)、功能與發(fā)育以及它們的分化和遺傳控制（Parks & Quail，1991）、分析鑒定基因功能（Hansson et al.，1999）、了解基因間互作（Lopez-Juez et al.，1998）有特殊價(jià)值，同時(shí)在育種工作中，葉色突變作為標(biāo)記性狀用于簡(jiǎn)化良種繁育和雜交制種，在生產(chǎn)實(shí)踐中具有重要的意義。國(guó)內(nèi)外關(guān)于葉色突變體的研究主要集中在水稻、小麥等大田作物，而關(guān)于番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）葉色突變的報(bào)道較少。Terry和Kendrick（1999）報(bào)道番茄黃葉突變體au和yg-2為核隱性基因突變，分別是血紅色素加氧酶和植物光敏色素合酶基因發(fā)生突變。王彥杰等（2007）以葉黃素缺失的番茄突變體為材料，研究葉黃素合成突變與光能分配和抗氧化酶活性的關(guān)系，結(jié)果表明葉黃素缺失體主要通過降低光能吸收和提高抗氧化能力來避免過剩光能導(dǎo)致光氧化脅迫的產(chǎn)生。

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄課題組于1998年在田間露地種植的中蔬 4號(hào)中發(fā)現(xiàn)自然突變的番茄葉色突變株，該突變株葉色黃化，成株苗葉片有黃斑，結(jié)果前期果實(shí)發(fā)白，轉(zhuǎn)色慢，但果實(shí)能正常轉(zhuǎn)為紅色，果實(shí)硬度大。將該突變株單獨(dú)留種，經(jīng)過多代自交形成遺傳穩(wěn)定的黃葉突變系。發(fā)現(xiàn)初期以果實(shí)顏色命名該突變體為番茄“白化”突變體（李景富 等，2006），后更名為番茄葉色黃化突變體。本試驗(yàn)對(duì)該番茄葉色黃化突變體的遺傳和相關(guān)基因的初步定位進(jìn)行研究，旨在為今后該基因的精細(xì)定位、克隆及其在育種中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試番茄材料及遺傳分析和定位群體的構(gòu)建

突變體材料：番茄葉色黃化突變體06883，系番茄中蔬4號(hào)06884中發(fā)現(xiàn)的自然突變株，經(jīng)6 a觀察，突變性狀能夠穩(wěn)定遺傳。常規(guī)材料：中蔬4號(hào)06884，栽培品種04973。以上材料均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄研究所提供。利用番茄葉色黃化突變體06883與中蔬4號(hào)配制正反雜交組合，F(xiàn)1自交獲得F2。F2群體用于番茄葉色黃化性狀的遺傳分析。將番茄葉色黃化突變體06883與04973雜交。F1自交獲得F2，該群體用于相關(guān)基因的分子定位。

1.2 遺傳分析方法

利用人工去雄、授粉的常規(guī)有性雜交法，將葉色黃化突變體與中蔬4號(hào)進(jìn)行正反交試驗(yàn)。F1單粒留種，單株收獲并貯藏。在苗期分別觀察統(tǒng)計(jì) F1、F2表型和植株數(shù)，并對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行χ2檢測(cè)。

1.3 DNA的提取

取番茄鮮嫩葉片，采用CTAB法提取親本和群體單株DNA，參照王關(guān)林和方宏筠（2002）的方法略作修改。用 Eppendouf蛋白核酸測(cè)定儀測(cè)定 DNA濃度，然后用去離子水將其稀釋至 50ng·μL-1。

1.4 番茄黃化突變基因的SSR分子標(biāo)記

共選用339對(duì)SSR引物用于篩選與葉色黃化突變基因連鎖的標(biāo)記，SSR引物序列分別來自SOL Genomics Network（http：//www.sgn.cornell.edu/index.pl）及文獻(xiàn)（Suliman-Pollatschek et al.，2002；He & Poysa，2003），覆蓋番茄的12條染色體，能夠?qū)θ~色黃化突變基因進(jìn)行初步定位。引物由上海生工生物工程有限公司合成。反應(yīng)體系：模板 DNA 20ng，1×PCR Buffer，dNTP 0.2 mmol·L-1，MgCl22.0mmol·L-1，引物 0.3 μmol·L-1，Taq DNA polymerase 1 U，加 ddH2O 補(bǔ)至20μL。在BiometraPCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 ℃下預(yù)變性5 min，94 ℃下變性1 min，Tm值（45～55 ℃）下退火1 min，72 ℃下延伸2 min，38個(gè)循環(huán)；最后72 ℃下延伸10min后保存在4 ℃條件下。反應(yīng)產(chǎn)物加入5 μL變性液，在PCR儀中95 ℃變性5 min后立即置于冰水混合物中。用6 %的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，100V電泳約1 h。最后銀染顯色分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

SSR為共顯性標(biāo)記，分離后代同父本04973的純和帶型記為“1”，同母本06883的純和帶型記為“2”，兩親本的雜合帶型記為“3”，帶型模糊或缺失記為“0”。利用Mapmaker/EXP 3.0構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖譜，應(yīng)用Mapchart 2.1軟件繪制遺傳圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉色黃化突變體的表型特征

06883葉色黃化突變體經(jīng)連續(xù)6 a觀察，群體均表現(xiàn)出黃化，無分離現(xiàn)象，性狀穩(wěn)定。該突變體子葉顏色展平時(shí)與正常植株一樣為綠色，約10d后，突變體子葉顏色漸漸變黃，且顏色均勻。隨著苗齡的延長(zhǎng)，新出的真葉為正常綠色，至四葉一心期，第一片真葉從葉尖邊緣向葉基部開始失綠，直至整個(gè)葉片變黃，最后衰老、死亡的葉片顏色幾乎為白色。在植株生長(zhǎng)過程中，葉片變黃的同時(shí)，主莖顏色也由綠色慢慢變成黃色，且靠近土壤的植株莖部顏色呈淡紫紅色。葉色黃化突變體與正常植株葉色有明顯差異，表現(xiàn)出不同程度的黃化現(xiàn)象，由下至上，黃化程度依次減弱，僅新出葉片為綠色，而突變體與正常植株在生長(zhǎng)勢(shì)上沒有顯著差異。突變體果實(shí)呈白色，轉(zhuǎn)色非常慢，但成熟后期能夠轉(zhuǎn)為紅色，且果實(shí)產(chǎn)量與中蔬4號(hào)06884差異不顯著，硬度大，耐貯藏。

2.2 葉色黃化突變體的遺傳分析

葉色黃化突變體06883與中蔬4號(hào)的正反交試驗(yàn)顯示，F(xiàn)1群體均表現(xiàn)為正常植株葉色，觀察結(jié)果說明葉色黃化性狀為隱性性狀。其F2群體均分化出葉色黃化突變株和正常綠色株兩種類型，說明葉片黃化性狀受主效基因控制。F2中綠葉和黃化葉的分離比值都接近3∶1（表1），卡方測(cè)驗(yàn)差異均不顯著。說明該性狀是受1對(duì)隱性主效核基因控制。

表1 中蔬4號(hào)與葉色黃化突變體06883正反交后代的分離表現(xiàn)

2.3 番茄葉色黃化基因的定位

用SGN上已經(jīng)公布在1～12條染色體上的159對(duì)SSR標(biāo)記和相關(guān)文獻(xiàn)上的188對(duì)SSR引物，對(duì)突變體和普通栽培品種04973進(jìn)行多態(tài)性分析，經(jīng)過初步篩選，發(fā)現(xiàn)共有20對(duì)SSR標(biāo)記在兩親本之間表現(xiàn)出多態(tài)性。再利用BSA法在F2中建立混合基因池，對(duì)這20對(duì)引物進(jìn)行再次篩選，最終發(fā)現(xiàn)有13對(duì)引物表現(xiàn)與分離群體表現(xiàn)一致。進(jìn)一步用這13對(duì)多態(tài)性SSR標(biāo)記對(duì)F2群體225個(gè)單株進(jìn)行連鎖分析，最終有3對(duì)引物與該突變基因連鎖。3對(duì)引物的名稱及序列見表2。

表2 與突變基因連鎖的SSR引物名稱及序列

結(jié)果發(fā)現(xiàn)番茄葉色黃化基因位于第11條染色體上，與LEaat006、LEtat002和Tom196-197連鎖，與它們的連鎖距離分別為8.9、16.3和18.7cM（圖2）。Tom196-197在分離群體黃綠葉個(gè)體中的表現(xiàn)見圖1。

圖1 SSR引物Tom196-197在兩親本質(zhì)檢的多態(tài)性及其在F2部分分離群體中的分離情況

3 討論

葉色突變是自然發(fā)生突變頻率較高的一種變異，造成葉色突變的原因很多，突變的類型也較多（苗晗 等，2007）。目前報(bào)道比較常見的是溫敏型葉色突變體，如溫敏型水稻葉色突變體W1在高溫下幼苗為正常綠色，而在低溫（15～20℃）下表現(xiàn)白化（崔海瑞 等，2001）；小麥返白系在苗期表現(xiàn)正常，但春季小麥返青時(shí)，返白系自心葉基部白化，后自下而上逐葉白化面積加大，隨溫度升高，又自心葉基部復(fù)綠（郭藹光 等，1991）。而另一類常見的葉色突變體的表現(xiàn)不受環(huán)境影響，如國(guó)艷梅等（2003）從黃瓜雌性系9110G中發(fā)現(xiàn)能夠穩(wěn)定遺傳的葉色突變體；在水稻品種武運(yùn)粳7號(hào)中發(fā)現(xiàn)黃綠葉自然突變體（王軍 等，2006）；曹莉等（2006）在小麥西農(nóng) 1718高代品系中發(fā)現(xiàn)自發(fā)黃化突變體等。此類突變體的葉色突變性狀能夠穩(wěn)定遺傳，不受環(huán)境影響，能夠作為葉色指示性狀的標(biāo)準(zhǔn)，可以應(yīng)用于苗期標(biāo)記輔助選擇育種中。本課題組發(fā)現(xiàn)的葉色黃化突變體是自然誘發(fā)的葉色突變體，經(jīng)連續(xù)多代自交后發(fā)現(xiàn)是能穩(wěn)定遺傳不受環(huán)境影響的葉色突變體。遺傳分析表明，該葉色黃化性狀受1對(duì)隱性核基因控制，田間特征表現(xiàn)為子葉展開15 d后變?yōu)辄S色，真葉于四葉一心期開始轉(zhuǎn)色，莖為黃色而莖根部為淡紫紅色，這些性狀都可以作為苗期標(biāo)記性狀應(yīng)用于育種工作中。

某些葉色突變體具有特殊的優(yōu)良性狀，為作物遺傳育種提供了優(yōu)秀的種質(zhì)資源。Gan和Amasino（1995）曾用轉(zhuǎn)基因技術(shù)誘發(fā)了1個(gè)煙草常綠突變體，此種突變體的生物學(xué)產(chǎn)量和種子產(chǎn)量分別增加了40%和52 %。陸地棉黃綠苗突變體浙12-12N幼苗期真葉葉綠素含量?jī)H為常綠苗泗棉2號(hào)的66 %，其各葉位葉片的水分利用率、光能利用率及凈光合速率卻高于泗棉2號(hào)，其子棉產(chǎn)量和皮棉產(chǎn)量較泗棉2號(hào)有所提高（戴日春 等，1995）。張賀（2008）對(duì)番茄葉色黃化突變體的光合特性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在高光照強(qiáng)度下突變體的凈光合速率降低的幅度高于正常葉色植株，但在低光照強(qiáng)度（200μmol·m-2·s-1）下突變體凈光合速率卻高于正常葉色植株，說明該突變體是較好的耐弱光材料。同時(shí)，孟凡娟等（2006）對(duì)番茄葉色黃化突變體果實(shí)的研究發(fā)現(xiàn)，突變體果實(shí)內(nèi)色素含量低于正常品種，耐貯性和硬度都優(yōu)于正常品種，但與一般耐貯品種品質(zhì)相比，突變體果實(shí)的品質(zhì)與正常品種相差不大。

番茄葉色突變體報(bào)道研究較深入的是au和yg-2突變體（Terry & Kendrick，1996；van Tuinen et al.，1996），Balint-Kurti等（1995）應(yīng)用RFLP技術(shù)將au基因定位在第11條染色體上，van Tuinen等（1997）同樣應(yīng)用 RFLP技術(shù)驗(yàn)證了 Kerr（1979）提出的 yg-2基因可能在第12條染色體上的結(jié)論。本課題組前期已經(jīng)對(duì)該葉色黃化突變體的形態(tài)、生理性狀等進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。本試驗(yàn)中，應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)番茄葉色黃化突變體進(jìn)行了初步定位，將相關(guān)突變基因定位在第11條染色體上兩個(gè)標(biāo)記LEaat006和LEtat002之間，后續(xù)的工作將對(duì)LEaat006和LEtat002區(qū)段進(jìn)行新標(biāo)記的開發(fā)及精細(xì)作圖，并為最終圖位克隆該基因奠定基礎(chǔ)。

圖2 番茄葉色黃化控制基因的遺傳定位

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