魏 峰，殷麗紅，許 越，楊歡歡，張西臣

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062)

柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(Eimeria tenella)是球蟲(chóng)病爆發(fā)中致病性最強(qiáng)的蟲(chóng)種之一，主要侵害雞盲腸，通過(guò)裂殖體在盲腸上皮細(xì)胞中大量增殖，破壞腸黏膜，引起腸管發(fā)炎和上皮細(xì)胞崩解[1-2]。目前，藥物防治多采用抗生素類(lèi)和化學(xué)合成藥物，但由于耐藥蟲(chóng)株的出現(xiàn)及殘留藥物對(duì)人體的危害，使藥物防治受到限制[3]。免疫預(yù)防已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，但目前對(duì)球蟲(chóng)的免疫機(jī)制尚未完全闡明，同種不同株、不同發(fā)育階段的蟲(chóng)體抗原成分均存在一定的差異。因此，鑒定其共同保護(hù)性抗原對(duì)球蟲(chóng)疫苗的研制及免疫機(jī)理的研究具有重要的意義。吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部寄生蟲(chóng)研究室利用E.tenella廣州株、長(zhǎng)春株、黑龍江株雜交獲得雜交株，為研究球蟲(chóng)共同保護(hù)性抗原奠定基礎(chǔ)[4]。本研究通過(guò)E.tenella雜交株對(duì)其親本株的免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)，研究雜交株對(duì)親本株的免疫保護(hù)及細(xì)胞免疫在球蟲(chóng)免疫中的作用，從而，為球蟲(chóng)免疫機(jī)理研究和疫苗研制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 蟲(chóng)株E.tenella廣州株為廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔡建平研究員惠贈(zèng)；E.tenella長(zhǎng)春株及黑龍江株均為吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部寄生蟲(chóng)研究室保存；E.tenella雜交株為吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部寄生蟲(chóng)研究室利用E.tenella廣州株、長(zhǎng)春株和黑龍江株雜交獲得。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng) 1日齡AA肉雞500只購(gòu)自吉林德大肉種雞公司，自行配制無(wú)抗球蟲(chóng)藥全價(jià)飼料，80℃烘烤1 h，自由采食、飲水，24 h光照，嚴(yán)格消毒，在無(wú)球蟲(chóng)環(huán)境下飼養(yǎng)，10日齡～11日齡連續(xù)2 d糞檢無(wú)球蟲(chóng)卵囊雞用于試驗(yàn)。

1.3 免疫保護(hù)性檢測(cè)

1.3.1 免疫保護(hù)率測(cè)定 12日齡時(shí)逐只稱(chēng)重，淘汰體重過(guò)大和過(guò)小者，400只無(wú)球蟲(chóng)雛雞隨機(jī)分為20組，每組20只；用E.tenella廣州株、長(zhǎng)春株、黑龍江株、雜交株各感染4組，劑量為1×104個(gè)卵囊/只，設(shè)4個(gè)不感染對(duì)照組。24日齡時(shí)分別用廣州株、長(zhǎng)春株、黑龍江株和雜交株對(duì)各組雞攻蟲(chóng)，劑量為103個(gè)卵囊/只；攻蟲(chóng)后7 d進(jìn)行OPG計(jì)數(shù)、糞便計(jì)分、盲腸病變計(jì)分[5]、平均增重和保護(hù)率計(jì)算，分析各數(shù)據(jù)(表1)。

保護(hù)率＝(各株空白組攻蟲(chóng)OPG數(shù)-各株攻蟲(chóng)后OPG數(shù))/各株空白組攻蟲(chóng)OPG數(shù)

1.3.2 細(xì)胞免疫檢測(cè) 50只12日齡無(wú)球蟲(chóng)AA肉雞隨機(jī)分成1個(gè)空白對(duì)照組，4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組12日齡用雜交株感染，劑量為104個(gè)卵囊/只，24日齡時(shí)分別用廣州株、長(zhǎng)春株、黑龍江株和雜交株攻蟲(chóng)，劑量為103個(gè)卵囊/只，攻蟲(chóng)后10 d，各組雞翅下采血1 mL，抗凝處理后進(jìn)行鼠抗雞CD4+T、CD8+T單克隆抗體(MAb)標(biāo)記，標(biāo)記血樣利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+T、CD8+T細(xì)胞水平，比較各親本株攻蟲(chóng)后對(duì)雞細(xì)胞免疫的影響(表2)。

表1 雜交株及各親本株免疫保護(hù)性Table 1 Immuneprotection of chickens immunized withE.teuellahybrid strain against different parent strain challenging(n=20)

表2 雜交株免疫雛雞對(duì)親本株攻蟲(chóng)后CD4+T、CD8+T細(xì)胞檢測(cè)Table 2 CD4+T and CD8+T cell level of chickens immunized with hybird strain and challenged by parent strains(n=10)

2 結(jié)果與討論

2.1 免疫保護(hù)率結(jié)果 表1結(jié)果顯示：E.tenella雜交株、廣州株、長(zhǎng)春株和黑龍江株對(duì)同株的免疫保護(hù)率分別為87.7%、83.6%、72.5%和75.1%；廣州株、長(zhǎng)春株和黑龍江株對(duì)其它親本株的平均免疫保護(hù)率為64.9%、60.4%和65.1%，而雜交株免疫的雛雞對(duì)廣州株、長(zhǎng)春株和黑龍江株3個(gè)親本株的免疫保護(hù)率分別為83.9%、79.1%和81.2%，平均為81.4%，極顯著高于其它地理株的交叉保護(hù)率(p<0.01)。雜交株對(duì)其親本株的免疫保護(hù)率較高，而各親本株對(duì)其他株的攻蟲(chóng)免疫保護(hù)率較低，免疫保護(hù)率順序?yàn)椋弘s交株(81.4%)>黑龍江株(65.1%)>廣州株(64.9%)>長(zhǎng)春株(60.4%)，雜交株可能遺傳了3個(gè)親本株的某些性狀(如抗原等)，特別是雜交株對(duì)長(zhǎng)春株和黑龍江株的免疫保護(hù)率高于其他株，其原因有待于進(jìn)一步研究。而盲腸病變計(jì)分和糞便計(jì)分試驗(yàn)結(jié)果顯示：雜交株顯著低于廣州株、長(zhǎng)春株和黑龍江株(p<0.05)；所有免疫組雛雞平均增重均高于空白對(duì)照組，表明經(jīng)過(guò)免疫后雛雞獲得保護(hù)力，能夠抵抗球蟲(chóng)的再次感染。各株的致病性有明顯差異，其順序?yàn)?以O(shè)PG計(jì))：廣州株>長(zhǎng)春株>黑龍江株>雜交株，雜交株致病性較弱而其免疫保護(hù)率較高。對(duì)球蟲(chóng)免疫研究顯示，不同種的球蟲(chóng)抗原存在差異，同種不同株間也存在著抗原差異，同一個(gè)體的不同發(fā)育階段抗原也不相同。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明E.tenella廣州株、長(zhǎng)春株和黑龍江株之間存在抗原差異。

2.2 細(xì)胞免疫結(jié)果 表2結(jié)果顯示：4個(gè)試驗(yàn)組的雛雞外周血液中CD4+T、CD8+T細(xì)胞數(shù)量均顯著高于對(duì)照組，其中以雜交株和廣東株較高，各組引起的CD4+T數(shù)量增加明顯高于CD8+T數(shù)量增加，CD4+T/CD8+T差別不大，表明不同雜交株球蟲(chóng)感染能夠引起明顯的細(xì)胞免疫。在球蟲(chóng)的免疫機(jī)制中抗體的作用很小[6]，CD4+T、CD8+T細(xì)胞在免疫中發(fā)揮著重要作用[7-8]，本實(shí)驗(yàn)中，CD4+T、CD8+T細(xì)胞在攻蟲(chóng)10 d后其數(shù)量均有明顯增加，尤其是CD4+T細(xì)胞增加較多，試驗(yàn)組CD4+T/CD8+T比值顯著高于對(duì)照組。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Shirle對(duì)耐藥雜交株可耐受多種藥物的結(jié)果相似，也與吉林大學(xué)分子寄生蟲(chóng)學(xué)研究室的研究結(jié)果相似[9-10]。這些研究為雞球蟲(chóng)活苗在不同地區(qū)的正確使用提供了依據(jù)，為下一步找出球蟲(chóng)保護(hù)性抗原奠定了基礎(chǔ)。

[1]Dalloul R A,Lillehoj H S.Recent advances in immunomo-dulation and vaccination strategies against coccidiosis[J].Avian Dis,2005,49:1-8.

[2]Allen P C,Fetterer R H.Recent advances in biology and immunobiology of Eimeriaspecies and in diagnosis and control of infection with these coccidian parasites of poultry[J].Clin Microbiol Rev,2002,15:58-65.

[3]Vertommen M H,Deek H W.How can a resistance problem be broken[J].World Poultry,1993,9:19-21.

[4]趙權(quán)，張西臣.不同地理株及其雜交株柔嫩艾美耳球蟲(chóng)免疫保護(hù)性研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，27(1)：100-103.

[5]索勛，李國(guó)清.球蟲(chóng)病學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1998，357-396.

[6]段嘉樹(shù)，程金科，趙樹(shù)英，等.球蟲(chóng)疫苗免疫防治縱橫談[J].當(dāng)代畜牧，1994，12：13-20.

[7]查紅波，蔣金書(shū).球蟲(chóng)保護(hù)性免疫機(jī)制[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志1997，23(11)：47-48.

[8]Arakawa A,Xie M Q.Control of coccidiosis in chickens[J].J Protozool Res,1993,3:31-39.

[9]Shirley M W.A molecular karyotype of Eimeria tenellaasrevealed by contourclamped homogenous electric field gel electrophoresis[J].Mol Biochem Parasitol,1990,38:169.

[10]張偉信，張西臣，李建華，等.五種不同地理株柔嫩艾美耳球蟲(chóng)免疫保護(hù)性比較[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，4：454-456.