鄧小蕓，祁小樂，高玉龍，高宏雷，秦立廷，高 立，王永強，王笑梅*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室/禽傳染病研究室，黑龍江 哈爾濱 150001；2.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.黑龍江畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院，黑龍江 雙城 150111)

網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(Reticuloendotheliosis，RE)是由RE病毒(REV)引起的禽類以急性網(wǎng)狀細胞腫瘤形成、矮小綜合征、淋巴組織和其它組織的慢性腫瘤形成為特征的一群病理綜合癥[1]。REV感染不僅能引起腫瘤，還可引起感染雞胸腺、法氏囊等免疫器官萎縮，造成感染雞的免疫功能下降、甚至喪失，導致免疫抑制，使感染雞極易繼發(fā)感染其他病毒病和細菌病。

REV屬于γ反轉(zhuǎn)錄病毒屬，有囊膜，基因組為單鏈正義RNA。非缺陷型病毒基因組長約8.2 nt，缺陷型病毒長約5.7 nt。REV基因組含有兩個開放閱讀框(ORF)，編碼3個蛋白(gag、pol和env)，兩側(cè)為長末端序列(Long terminal region，LTR)[2]。

1 材料和方法

1.1 病毒株、細胞、載體和菌種 REV HLJR0901株由哈爾濱獸醫(yī)研究所禽免疫抑制病課題組從黑龍江省分離并鑒定；pMD18-T載體購自TaKaRa公司；HLJR0901的全基因組分別分段克隆于6個重組質(zhì)粒中[12]，依次為pT-F1、pT-F2、pT-F3、pT-F4、pT-F5、pT-F6，pBluescriptⅡ KS(+)載體、Top10F'菌種由本課題組保存。

1.2 主要試劑 PrimeSTARTMHS DNA Polymerase、dNTP等購自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶DpnⅠ購自NEB公司；Plasmid Midi Kit購自QIAGEN公司；LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；Opti-MEM I Medium購自GIBCO公司；FITC標記的抗雞IgG購自Sigma公司；雞抗REV多克隆抗體購自美國Charles River公司。

1.3 引物設計 用于全基因組的各片段擴增及基因組拼接的引物見表1。另外，用于基因組分子標簽引入的引物為：RevC2250GU：5'-ACTCAGAAGAT GGCgAAGGTACTACTCGC-3'和 RevC2250GL：5'-G CGAGTAGTACCTTcGCCATCTTCTGAGT-3'(小寫字母代表突變的核苷酸)。引物由英俊生物技術有限公司(Invitrogen)合成。

表1 擴增REV前病毒基因組(pre-DNA)所用引物Table 1 Primers used for REV pre-DNA amplification

1.4 HLJR0901全基因組的拼接及分子標簽的引入利用相應引物，分別從重組質(zhì)粒pT-F1、pT-F2、pT-F3、pT-F4、pT-F5、pT-F6中擴增出6個連續(xù)且部分重疊的HLJR0901基因組片段，分別命名為F1～F6。用重疊延伸PCR(SOE PCR)技術將 F1、F2和F5拼接起來，具體步驟如下：先用F5上游引物和F1下游引物通過SOE PCR獲得片段F51，然后再用F5上游引物和F2下游引物將F51和F2拼接為 F512(基因組 1 bp～4546 bp)，將其克隆于pMD18-T載體中，獲得重組質(zhì)粒pT-F512。采用同樣的技術用相應引物將F2、F3、F4和F6逐步融合拼接為F2346(基因組2368 bp～8284 bp)，將其克隆于pMD18-T載體中，獲得重組質(zhì)粒pT-F512，然后將其亞克隆于pBluescriptⅡKS(+)載體中，獲得重組載體pBlu-F236。

以pT-F512為模板，用PrimeSTARTMHS DNA Polymerase通過PCR的方法在HLJR0901基因組上引入無意義突變C2250G作為分子標簽，所用引物為RevC2250GU和 RevC2250GL。然后用 DpnⅠ降解PCR產(chǎn)物中被甲基化模板pT-F512，將處理過的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞Top10F'，提取并篩選陽性質(zhì)粒，命名為pT-mF512。重組質(zhì)粒由英俊生物技術有限公司測序。

1.5 HLJR0901感染性分子克隆的構建 用EcoRⅠ和SphⅠ將mF512從pT-mF512切下，克隆于經(jīng)同樣酶切處理的pBlu-F236，獲得含有帶分子標簽的HLJR0901全基因組的重組質(zhì)粒pBlu-mHLJR0901。經(jīng)EcoRⅠ酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒由英俊生物技術有限公司測序。

1.6 重組質(zhì)粒pBlu-mHLJR0901轉(zhuǎn)染及病毒拯救用QIAGEN Plasmid Midi Kits制備純化pBlu-mHLJR 0901。由 LipofectamineTM2000介導轉(zhuǎn)染約 60%單層的雞胚成纖維細胞(CEF)細胞。同時以正常CEF為對照。轉(zhuǎn)染后6 h棄細胞上清，用Hanks液洗細胞3次，加入2 mL DMEM(含10%PAA胎牛血清和100 u/mL雙抗)置37℃CO2繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后7 d收獲病毒，反復凍融3次后連續(xù)在CEF中傳代。經(jīng)鑒定后將拯救的病毒命名為rHLJR0901。

1.7 病毒粒子鑒定

此類影響主要指的為寄生蟲、病媒昆蟲的生長由于受到外界氣候變化的影響而對牛羊疾病的造成的影響。牛羊寄生蟲病的出現(xiàn)、傳播等受其生長、發(fā)育環(huán)境的氣候條件的影響較大，且具有顯著的地域性以及季節(jié)性特點。具體而言：基于溫度的提升或者降水量的增加，寄生蟲的繁殖速度越來越快，這就導致牛羊相關疾病的可能性大幅度提升，包括單一寄生蟲感染類疾病和多種寄生蟲混合感染類疾病。我國的西北區(qū)域多為放牧地帶，于降雨量較多的時節(jié)，該區(qū)域的寄生蟲數(shù)量會大幅度增加，同時，牛羊患寄生蟲病的概率也會隨之提升。

1.7.1 間接免疫熒光 將拯救的第5代病毒按常法接種于約60%單層的CEF 96孔板中，7 d后按常規(guī)方法進行間接免疫熒光檢測。一抗為雞抗REV多克隆抗體，二抗為FITC標記的抗雞IgG。同時設不接種病毒細胞對照。

1.7.2 PCR及分子標簽鑒定 取CEF細胞培養(yǎng)的病毒懸液200 μL，分別加蛋白酶K和SDS至終濃度為100 mg/L和0.5%，56℃消化3 h～4 h；分別用苯酚/氯仿按常規(guī)方法抽提，提取DNA，以其為模板進行PCR擴增REV的F1片段。將PCR產(chǎn)物克隆于pMD18-T中，由英俊生物技術公司測序。

1.7.3 電鏡檢查 病毒感染CEF細胞后第7 d，取感染細胞，用PBS離心洗滌，將沉淀用固定液固定，制作超薄切片進行電鏡觀察。

1.8 拯救的REV復制動力學比較 用Hank's液將第5代病毒液10倍遞次稀釋為10-1～10-55個稀釋度，分別接種于CEF，每個稀釋度做8個重復，培養(yǎng)7 d后，做間接免疫熒光檢測，按Reed-Muench法計算rHLJR0901的組織半數(shù)感染量(TCID50)。以104TCID50病毒接種單層的CEF(約106個細胞)，感染后3 d、5 d、7 d分別取細胞上清，滴定其TCID50效價。重復測定3次，取其平均值，繪制病毒復制動力學曲線。同時設親本毒對照。

2 結果

2.1 HLJR0901感染性分子克隆的構建 以6個分別含有REV不同片段的重組質(zhì)粒為模板，通過SOE PCR將HLJR0901全基因組克隆于pBluescriptⅡ中，并經(jīng)點突變(C2250G)構建了具有分子標簽REV感染性質(zhì)粒pBlu-mHLJR0901。EcoRⅠ酶切鑒定pBlu-mHLJR0901大小約 11000 bp(圖 1)；pBlumHLJR0901的測序結果顯示，其全基因組核酸序列(除C2250G點突變外)與親本病毒HLJR0901的序列一致；同時顯示，C2250G經(jīng)人工點突變消除了原有的MscⅠ限制性內(nèi)切酶酶位點，可以作為鑒別親本病毒的分子標簽。

圖1 pBlu-mHLJR0901的酶切鑒定Fig.1 Identification of pBlu-mHLJR0901 by restriction enzyme digestion

2.2 REV的拯救 將pBlu-mHLJR0901轉(zhuǎn)染CEF，由于REV不引起細胞病變(CPE)，每隔7 d傳代，共傳3代～5代。對盲傳的細胞轉(zhuǎn)染物進行鑒定，確定是否獲得拯救病毒。

2.3 拯救的病毒粒子鑒定

2.3.1 間接免疫熒光 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CEF細胞以及盲傳過程中，均沒有出現(xiàn)CPE。雞抗REV多克隆抗體介導的間接免疫熒光檢測拯救的盲傳第5代病毒，可觀察到綠色特異性熒光，而正常細胞對照未觀察到熒光(圖2)。

2.3.2 PCR及分子標簽測定 以拯救的REV第5代總細胞DNA為模板進行PCR擴增得到了預期的約1800 bp的片段(圖略)。測序結果顯示，分子標簽(C2250G)存在(圖 3)。

2.3.3 電鏡檢查 電鏡下可觀察到rHLJR0901細胞培養(yǎng)物中存在直徑80 nm～100 nm有囊膜的病毒粒子(圖4)，與REV的形態(tài)結構一致。而未接毒細胞對照在電鏡下沒有觀察到病毒粒子。

2.4 拯救的REV復制動力學 復制動力學曲線顯示，拯救的REV rHLJR0901與親本毒HLJR0901在CEF細胞上具有相似的復制特性，接毒后7 d的病毒效價可達105TCID50/mL以上，兩者之間無顯著性差異(圖 5)。

3 討 論

本研究采用SOE PCR的方法將我國東北REV分離株HLJR0901全基因組拼接，構建了感染性克隆 pBlue-mHLJR0901，轉(zhuǎn)染 CEF獲得拯救病毒。REV屬于反轉(zhuǎn)錄病毒，前病毒全基因組克隆被轉(zhuǎn)染于CEF后，即可利用宿主細胞的RNA聚合酶Ⅱ，啟動轉(zhuǎn)錄、翻譯過程，并最終完成病毒的包裝和釋放。所以在設計REV感染性克隆時，不用額外考慮啟動子和核酶序列等修飾因子。為鑒別拯救的REV和野毒，本研究采用定點突變的方法在基因組中引入了單點突變C2250G作為分子標簽，該突變將MscⅠ限制性酶切位點(TGGCCA)突變消除。經(jīng)序列分析，HLJR0901株及其它REV毒株如：APC-566(DQ387450)、HA9901(AY842951)、HLJ07I(GQ375848)、3122/03(DQ513316)、3295/04(DQ513317)、chicken/3337/05(FJ439120)、goose/3410/06(FJ439119)、PCR92(DQ237901)、FA(AF246698)、SNV(DQ003591)等在該位置均存在MscⅠ限制性酶切位點(TGGCGA)，而本實驗拯救的毒株rHLJR0901無此位點。

影響病毒拯救效率的因素是多方面的。首先，為保證轉(zhuǎn)染用的質(zhì)粒質(zhì)量，最好選用轉(zhuǎn)染級別的質(zhì)粒提取試劑盒。本研究選用QIAGEN公司的Plasmid Midi Kit，所提質(zhì)粒超螺旋占多數(shù)，轉(zhuǎn)染效率100%，遠高于其他方法提取的質(zhì)粒；第二是轉(zhuǎn)染方法，常見的轉(zhuǎn)染DNA的方法有脂質(zhì)體法、磷酸鈣法、電擊法等，不同的系統(tǒng)可能適用不同的方法。本研究采用的轉(zhuǎn)染試劑是LipofectamineTM2000。本研究建立REV反向遺傳操作系統(tǒng)穩(wěn)定性良好，在CEF細胞中進行了3批12次轉(zhuǎn)染，均成功拯救出病毒。

據(jù)報道，REV有望用做將外源基因?qū)腚u和哺乳動物細胞內(nèi)的載體[13]，這類載體在轉(zhuǎn)基因雞和人的基因治療方面具有良好的應用前景。因此，可以利用反向遺傳操作系統(tǒng)將REV感染性克隆改造成為一種病毒載體，在基因治療等方面發(fā)揮作用。另外，本研究建立的REV國內(nèi)流行毒株的反向遺傳操作系統(tǒng)，具有簡便、高效、穩(wěn)定性好等特點，為深入開展REV基因功能等研究奠定了基礎。

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