李勇剛朱 默戴穎鈺陳劍華倪健坤郭 亮

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)及其并發(fā)癥是威脅人類健康的重要疾病之一,是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)。在我國,本病的發(fā)病率呈逐年增加的趨勢[1]。巨噬細胞參與了AS發(fā)生發(fā)展的全過程,并與斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)[2]。超小順磁性氧化鐵(ultrasm-all superparamag netic iron oxide,USPIO)是一種新型的血池型磁共振對比劑,能被巨噬細胞特異性吞噬。因此,采用USPIO增強MRI有望通過顯示AS斑塊內(nèi)的巨噬細胞,實現(xiàn)早期診斷及評估AS斑塊穩(wěn)定性。本研究通過球囊損傷結(jié)合高脂飲食飼養(yǎng)的辦法建立實驗性兔AS模型,采用USPIO增強MRI檢測兔AS斑塊的形態(tài)、數(shù)目和成分,探索一種新的AS斑塊檢測及穩(wěn)定性評估方法。

方 法

1.實驗動物及模型制作

選用健康雄性新西蘭大白兔30只,體重1.5～2.0kg,由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。所有動物隨機分為兩組,實驗組20只,對照組10只。

AS模型制作采用球囊損傷結(jié)合高脂飲食飼養(yǎng)法。采用4F球囊導(dǎo)管,經(jīng)股動脈穿刺插入至胸主動脈,加壓注入稀釋的碘普胺使球囊張開,壓力維持在4～5kPa。透視下定位,自胸主動脈開始拉動球囊至腹主動脈末端,反復(fù)3次,術(shù)后每日肌注青霉素40萬單位,連續(xù) 3d。2周后,模型兔行高脂飼料喂養(yǎng)(高脂飼料委托蘇州雙獅實驗動物飼料公司配制,成分比例為2%膽固醇、10%豬油、88%基礎(chǔ)飼料),飼養(yǎng)14周后行MRI檢查。

2.磁共振檢查

2.1 動物麻醉:先經(jīng)耳緣靜脈注射地西泮(安定)1m l,然后肌注速眠新Ⅱ0.2m l/kg。

2.2 MR掃描序列及參數(shù):采用Philips Eclipse 1.5TMRI掃描儀,膝關(guān)節(jié)線圈。USPIO增強前、后掃描序列包括:3D-TOF(TR=30ms,TE=6.7ms,翻轉(zhuǎn)角 30°,層厚 2mm,層間距0mm,矩陣 192×512);橫斷面TFET1WI(TR=470m s,TE=5ms,翻轉(zhuǎn)角為80°,層厚 5mm,層間距 0mm,矩陣256×256);橫斷面脂肪抑制SE T1WI(TR=300ms,TE=15m s,層厚5mm,層間距0mm,矩陣256×256);橫斷面FSET2WI(TR=3000ms,TE=85ms,層厚 5mm,層間距0mm,矩陣256×256);橫斷面FSEPDWI(TR=2500m s,TE=11.5ms,層厚5mm,層間距0mm,矩陣256×256)和橫斷面FFE T2WI(TR=600ms,TE=13.4ms,翻轉(zhuǎn)角為 30°,層厚 5mm,層間距 0mm,矩陣192×256)。橫斷面掃描范圍包括右腎動脈上、下方各4cm范圍。經(jīng)耳緣靜脈注入USPIO(蘇州大學(xué)材料與化工學(xué)部自制,直徑20nm)0.05mm ol/kg后,行MRI增強掃描,并間隔24h重復(fù)掃描一次,連續(xù)觀察5d。

2.3 圖像分析:觀察斑塊在不同序列上的信號變化,實驗組測量USPIO增強前、后斑塊區(qū)域信號強度,對照組測量相應(yīng)部位正常管壁信號強度。圖像信噪比計算公式如下:SNR=SI/SD。

SI(感興趣區(qū))為腹主動脈管壁的平均信號強度,SD(背景)為掃描野背景信號強度的標(biāo)準(zhǔn)差。在實驗組和對照組的T2WI上,測量管壁SNR。連續(xù)觀察5d,根據(jù)SNR變化情況確定增強后斑塊強化的峰值時間。

3.病理檢查

利用空氣栓塞法處死動物,解剖取出完整的主動脈,10%福爾馬林液固定。實驗組計算右腎動脈上、下4cm范圍內(nèi)的斑塊,以各個斑塊為中心取病理標(biāo)本。對照組相應(yīng)范圍腹主動脈取5個標(biāo)本,共獲得25張HE切片。所有標(biāo)本行HE染色和普魯士藍染色,光學(xué)顯微鏡下觀察斑塊的形態(tài)、成分以及鐵染色情況。

4.統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析,將模型組和對照組在注射USPIO前與注射后第4天所測的管壁SNR進行配對t檢驗。

結(jié) 果

1.動物模型及病理檢查結(jié)果

實驗組20例中,模型成功12例,8只意外死亡。存活12只兔均有斑塊形成,斑塊大部分位于腹主動脈,模型成功率為60%。對照組未出現(xiàn)意外死亡。

病理檢查顯示對照組血管壁柔軟、富有彈性,管壁光滑未見AS斑塊,鏡下見管壁各層結(jié)構(gòu)清晰,動脈內(nèi)膜厚度均勻一致,內(nèi)膜下未見泡沫細胞。普魯士藍染色顯示對照組兔腹主動脈管壁標(biāo)本均未見鐵顆粒沉積。

實驗組12例掃描范圍內(nèi)共可見86個AS斑塊,腹主動脈血管壁僵硬、彈性差,管腔內(nèi)高低不平,可見多個淡黃色斑塊凸出于管腔(圖1)。鏡下見動脈內(nèi)膜明顯增厚,內(nèi)膜下可見大量含脂質(zhì)的泡沫細胞,粥樣壞死物,管壁肌層可見增厚,平滑肌細胞增生,8個斑塊內(nèi)可見鈣化成分,11個斑塊纖維帽破損;高倍鏡下斑塊內(nèi)可見膽固醇針形結(jié)晶。普魯士藍染色顯示86個斑塊中,67個斑塊內(nèi)可見數(shù)量不等的鐵顆粒沉積,呈紫藍色(圖2)。

2.MRI表現(xiàn)

對照組USPIIO增強前、后MRI示掃描范圍內(nèi)腹主動脈管腔清晰,未見異常信號。3D-TOF序列示管壁光整,未見管腔狹窄。

與病理檢查對照發(fā)現(xiàn),實驗組67個普魯士藍染色陽性斑塊中,USPIO增強MRI可見明顯信號改變者共53個,占79.1%。根據(jù)斑塊內(nèi)成分不同,MRI掃描信號各異。中央脂質(zhì)核心呈不規(guī)則小點片狀T1WI(圖3A)、PDWI(圖 3B)及 T2＊WI(圖3C)稍高信號區(qū),T2WI(圖3D)呈等、低信號,脂肪抑制SE T1WI序列斑塊中央高信號區(qū)信號減低不明顯。纖維帽呈等T1、等T2信號,在 PDW I序列顯示較好,呈稍高信號,7個斑塊示纖維帽不完整,主要表現(xiàn)為纖維帽表面不規(guī)則。鈣化部分呈點狀長T1、短 T2信號。USPIO增強后T2WI及T2＊WI可見斑塊中央信號明顯明顯降低,以T2＊WI更為明顯(圖3E),注射對比劑后 96h負性強化達峰值,斑塊表面纖維帽及斑塊深部管壁信號變化均未見明顯變化。T1WI序列的斑塊早期信號輕度增高,以后信號變化不明顯。USPIO增強后各序列對纖維帽信號區(qū)別能力沒有明顯增加。MRI平掃白血序列顯示斑塊局部管腔不同程度環(huán)形或偏心狹窄,USPIO增強后后96h白血序列顯示斑塊區(qū)管壁信號明顯減低(圖3F)。對照病灶部位普魯士藍染色及HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),藍染的鐵顆粒主要沉積在內(nèi)膜下、泡沫細胞中以及泡沫細胞融合崩解的粥樣壞死物中。在內(nèi)膜脫落區(qū)及破裂的纖維帽裂口處亦可見部分藍染的鐵顆粒沉積。在完整的纖維帽、鈣化區(qū)、斑塊內(nèi)纖維素樣壞死區(qū)、深部平滑肌增殖區(qū)、深部及管周炎性反應(yīng)區(qū)均未見鐵顆粒沉積。普魯士藍染色陽性斑塊中,MRI未發(fā)現(xiàn)明顯信號改變者共14個,與病理對照發(fā)現(xiàn),其內(nèi)鐵顆粒沉積較少。

3.注射USPIO前后管壁SNR的定量測量。

實驗組與對照組USPIO增強前、后T2WI上病變區(qū)SNR測量結(jié)果見表1。實驗組USPIO增強前、后T2WI上病變區(qū)SNR的變化趨勢是起始逐漸下降,第4天達到最低點然后開始回升(圖4)。

表1 兩組注射USPIO前后血管壁SNR的定量測量結(jié)果

討 論

新西蘭大白兔是目前應(yīng)用廣泛的實驗性AS模型動物,Rekhter等[3]研究發(fā)現(xiàn)兔AS斑塊與人類AS斑塊在病理特征上具有極大相似性。目前,實驗性兔動脈粥樣硬化模型建立的方法主要有高脂飲食飼養(yǎng)以及球囊損傷結(jié)合高脂飲食飼養(yǎng)的方法。單純高脂飲食飼養(yǎng)動脈粥樣硬化斑塊好發(fā)于胸主動脈、主動脈弓及頸動脈分叉等處。本實驗采用高脂飼養(yǎng)加球囊拉傷的方法可使粥樣斑塊發(fā)生在易行磁共振檢查的腹主動脈,研究結(jié)果顯示,腹主動脈的中下段即球囊損傷的主要部位,可見較多斑塊,部分呈片狀分布,與胸主動脈及頸動脈分叉等部位比較,腹主動脈中下段背景噪聲小,血流偽影較少,圖像質(zhì)量易控制,且模型成功率高、制作周期短。

在AS發(fā)生發(fā)展過程中,巨噬細胞充當(dāng)了至關(guān)重要的作用。病變早期在局部細胞因子、趨化因子作用下,外周血單核細胞黏附于血管內(nèi)膜,轉(zhuǎn)化為巨噬細胞。巨噬細胞吞噬脂質(zhì),形成泡沫細胞,泡沫細胞的沉積,構(gòu)成了粥樣硬化斑塊的主要成分。隨著AS病變進一步加重,在巨噬細胞、血管平滑肌細胞以及炎癥細胞作用下,使T輔助細胞和樹突細胞相互間的作用加強導(dǎo)致了斑塊的破裂和血管內(nèi)血栓形成[4]。巨噬細胞參與了AS發(fā)生發(fā)展的全過程,并與斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān),諸多組織學(xué)資料表明斑塊內(nèi)的炎癥細胞(主要是巨噬細胞)的多少是決定宏觀上斑塊不穩(wěn)定性程度的重要因素,即斑塊內(nèi)巨噬細胞越多則越趨于不穩(wěn)定[5,6]。因此,將巨噬細胞作為成像的靶細胞可早期診斷AS病變并有助于評估斑塊穩(wěn)定性。

本研究顯示靜脈注入USPIO能被AS斑塊內(nèi)巨噬細胞吞噬,其引起的信號變化能被MRI白血及黑血成像序列檢測到。斑塊內(nèi)的脂質(zhì)成分在T1WI、PDW I和 T2＊WI為稍高信號,在T2WI上呈等低信號,這主要是由于纖維斑塊期脂質(zhì)核心形成后,其中心主要成分是膽固醇和含固態(tài)結(jié)晶或液晶態(tài)的膽固醇酯,由于膽固醇固體結(jié)晶及液晶態(tài)的膽固醇酯的T 2值較脂類明顯縮短,故其信號強度降低[7,8]。斑塊內(nèi)不規(guī)則顆粒狀脂質(zhì)核心的高信號在T1WI脂肪抑制序列上沒有完全的降低,這說明脂質(zhì)核心的高信號與普通脂肪的高信號是有區(qū)別的,病理切片上也發(fā)現(xiàn)了病灶內(nèi)存在膽固醇結(jié)晶。國內(nèi)、外研究也發(fā)現(xiàn)[9-11],復(fù)合斑塊中的脂質(zhì)核心成分較復(fù)雜,其中有膽固醇、膽固醇結(jié)晶、中性脂肪、磷脂等,所以常規(guī)的脂肪抑制序列不能被抑制。纖維帽成分在PDW I序列顯示較其他序列清晰,呈稍高信號。雖然在部分病理切片發(fā)現(xiàn)斑塊內(nèi)存在鈣化改變但在MRI上不易明確區(qū)分。注射USPIO后,MRI上主要表現(xiàn)為斑塊中央高信號的脂質(zhì)核心區(qū)信號降低明顯,纖維帽及深部管壁信號降低不明顯。鐵顆粒主要沉積在內(nèi)膜下、泡沫細胞中以及泡沫細胞融合崩解的粥樣壞死物中。在內(nèi)膜脫落區(qū)及破裂的纖維帽裂口處亦可見部分藍染的鐵顆粒沉積。完整的纖維帽、鈣化區(qū)、斑塊內(nèi)纖維素樣壞死區(qū)、深部平滑肌增殖區(qū)、深部及管周炎性反應(yīng)區(qū)均未見鐵顆粒沉積。這提示靜脈注射USPIO后,對比劑主要被大量聚集于內(nèi)膜下及脂質(zhì)核心區(qū)的巨噬細胞吞噬,從而引起MRI信號變化,也說明巨噬細胞在斑塊脂質(zhì)核心形成、擴大、斑塊破裂中起著重要的作用,其聚集程度是判斷斑塊的活動性及穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。在MRI上,完整或破裂纖維帽區(qū)信號變化均不明顯,可能是由于該區(qū)鐵顆粒沉積不如脂質(zhì)核心區(qū)多,且纖維帽在各個序列上信號強度偏低,USPIO主要是負性強化,因此,信號變化不如脂質(zhì)核心明顯。T2WI上監(jiān)測管壁SNR變化曲線顯示,注射USPIO前和以后的連續(xù)5d SNR的變化趨勢是起始逐漸下降,在第4天達到最低點,然后開始回升,這說明巨噬細胞對鐵顆粒吞噬的峰值時間在96h左右。本研究結(jié)果顯示,USPIO增強MRI基本能反映AS斑塊內(nèi)巨噬細胞聚集部位及聚集程度,有望用于斑塊活動性及穩(wěn)定性評估。本研究由于受MRI儀場強及線圈等因素影響,圖像分辨率有待提高。采用超高場強及專用線圈,提高探測敏感性及圖像分辨率,有望更精確地評估病變內(nèi)巨噬細胞的分布及聚集程度。

多序列MRI成像有助于AS斑塊成分的分析及斑塊穩(wěn)定性判斷,PDW I序列對纖維帽顯示較佳,有利于觀察纖維帽完整性。T2＊WI序列對USPIO增強后斑塊的負性強化顯示較敏感,有利于評估斑塊內(nèi)巨噬細胞的數(shù)量及評估斑塊炎癥反應(yīng)。MRI白血序列檢出斑塊數(shù)多于黑血序列,黑血技術(shù)對顯示斑塊大小、形態(tài)及成分優(yōu)于白血技術(shù),對斑塊性質(zhì)及穩(wěn)定性的評估價值較大,3D-TOF MRA覆蓋范圍大,對斑塊檢出敏感、直觀,可作為黑血成像前的定位手段。

總之,靜脈注入血池型MRI對比劑USPIO能被兔AS斑塊中巨噬細胞吞噬并導(dǎo)致斑塊MRI信號發(fā)生明顯變化,且持續(xù)時間較長,MRI多序列成像有助于顯示斑塊內(nèi)不同成分,USPIO增強MRI有望用于AS診斷及斑塊穩(wěn)定性評估。

1.Klein R,Klein BE,Knudtson MD,et al.Subclinical atherosclerotic cardiovascular disease and early age-related multiracial cohort:the multiethnic study of atherosclerosis.Arch Ophthalmol,2007,125:534-543

2.Elkind MS,Sciacca RR,Boden B,et a1.Leukocyte count is associated with reduced endothelial reactivity.Atherosclerosis,2005,181:329-338

3.Rekhter MD.How to evaluate plaque vulnerability in animal models of atherosclerosis?Cardiovasc Res,2002,54:36-41

4.Calin MV,Manduteanu I,Dragomir E,et al.Effect of depletion of monocytes/macrophages on early aortic valve lesion in experimental hyperlipidemia.Cell Tissue Res,2009,336:237-248

5.Shibata N,Glass CK.Regulation of macrophage function in inflammation and atherosclerosis.JLipid Res,2009,50:277-281

6.Elkind MS,Sciacca RR,Boden-Albala B,et a1.Leukocyte count is associated with reduced endothelial reactivity.Atherosclerosis,2005,181:329-338

7.Sirol VM,Itskovich V,Mani V,et al.Lipid-rich atherosclerotic plaques detected by gadolinium-enhanced in vivomagnetic resonance imaging.Circulation,2004,109:2890-2896

8.Kramer CM,Cerilli LA,Hagspiel K,et al.Magnetic resonance imaging identifies the fibrous cap in atherosclerotic abdominal aortic aneurysm.Circulation,2004,109:1016-1021

9.宋 瓊,夏黎明,王承緣,等.兔早期動脈粥樣硬化斑塊的MRI表現(xiàn)與組織病理學(xué)對照研究.中華放射學(xué)雜志,2006,40:431-433

10.趙輝林,劉曉晟,許建榮,等 .應(yīng)用3.0TMRI定量評價頸動脈斑塊負荷與缺血性腦卒中的關(guān)系.中國醫(yī)學(xué)計算機成像雜志,2009,15:13-17

11.Tang TY,Howar th SP,Miller SR,et al.Correlation of carotid atheromatous plaque inflammation using USPIO-enhanced MR imaging with degree of luminal stenosis.Stroke,2008,39:2144-2147