郭茂娟，馬東明，盧 斌，蘇金玲，范英昌，姜希娟

（1.天津中醫(yī)藥大學實驗教學部病理實驗室，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學病理教研室，天津 300193）

心腦血脈寧對家兔動脈粥樣硬化易損斑塊模型MMP-2、TIMP-2表達的影響*

郭茂娟1，馬東明1，盧 斌1，蘇金玲2，范英昌2，姜希娟2

（1.天津中醫(yī)藥大學實驗教學部病理實驗室，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學病理教研室，天津 300193）

[目的]探討心腦血脈寧對家兔動脈粥樣硬化易損斑塊模型基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶抑制因子-2（TIMP-2）表達的影響。[方法]通過喂養(yǎng)高脂飼料和主動脈球囊內皮拉傷術復制動脈粥樣硬化易損斑塊模型，實驗分為模型組，假手術組，心腦血脈寧組，歷時15周。處死后，取腹主動脈行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察鏡下病變，計數(shù)斑塊破裂數(shù)，免疫組化方法檢測MMP-2、TIMP-2蛋白含量。[結果]1）HE觀察：假手術組鏡下形態(tài)結構完整，模型組斑塊中心可見大量脂核，斑塊表面覆蓋纖維帽，在斑塊肩部可見殘存泡沫細胞和大炎細胞浸潤。心腦血脈寧組介于兩者之間。2）免疫組化結果：與假手術組相比，模型組MMP-2、TIMP-2蛋白含量明顯升高，差異有顯著性（P＜0.01）；心腦血脈寧組MMP-2與模型組比較表達降低，差異有顯著性（P＜0.01），而TIMP-2含量與模型組相比有降低趨勢，但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；心腦血脈寧組能夠有效降低兩者比值，與模型組相比差異有顯著性（P＜0.01）。[結論]心腦血脈寧干預家兔動脈粥樣硬化易損斑塊模型，能減少斑塊破裂，其機制可能與降低斑塊MMP-2含量以及調節(jié)MMP-2與TIMP-2比值有關。

心腦血脈寧；易損斑塊；基質金屬蛋白酶-2；基質金屬蛋白酶抑制因子-2

動脈粥樣硬化（AS）引發(fā)急性冠脈綜合征（ACS）是導致冠心病患者死亡的主要原因。近年來經過大量的臨床及動物實驗發(fā)現(xiàn)，易損斑塊的存在是引起臨床事件的罪魁禍首。這類斑塊容易發(fā)生破裂繼發(fā)附壁血栓形成或斑塊內出血使得斑塊體積迅速增大，造成惡性事件發(fā)生[1-2]。因此，如何穩(wěn)定斑塊成為研究熱點。

心腦血脈寧臨床上多年來用于治療不穩(wěn)定性心絞痛，且療效顯著，但是其作用機制尚未闡明，設想該復方的作用機制可能與穩(wěn)定斑塊有關，因此，以心腦血脈寧為研究對象，觀察該復方能否穩(wěn)定斑塊，并觀察心腦血脈寧對斑塊穩(wěn)定的具體作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼料 純系日本大耳白家兔40只，雄性，體質量1.7～2.0 kg，北京科宇動物養(yǎng)殖中心提供。飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學實驗動物中心（環(huán)境設施符合《中華人民共和國衛(wèi)生部實驗動物標準》二級標準）。單籠飼養(yǎng)，自由飲水。

高脂飼料組成：膽固醇2%（天津市英博生化試劑有限公司批號：060619，含量＞98%）、新遠牌大豆色拉油10%（秦皇島金海食品有限公司），普通飼料88%（天津市武清區(qū)科達養(yǎng)殖中心提供）。

1.2 藥物

1.2.1 受試藥物 心腦血脈寧由天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院提供[批準文號：津藥制字（2001）Z第0346 號]。成人服用劑量，1.6～2.4 g/次，3 次/d；組成：生黃芪、當歸、川芎、赤芍、水蛭等。

1.2.2 實驗藥物 蝰蛇毒：廣州蛇毒研究所；戊巴比妥鈉：SIGMA分裝；組胺：Fluka Chemie GmbH CH-9471Buchs；基質金屬蛋白酶抑制因子-2（TIMP-2）、基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）一抗 博士德生物工程有限公司 批號分別為BA0576、BA0569；二抗、三抗：中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所；DAB試劑盒：（ZLI-9032）北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗器材 輸尿管導管：上海上醫(yī)康鴿醫(yī)用器材有限責任公司（規(guī)格：F4，生產批號050802）。球囊：天津市中拓乳膠廠（內徑為0.9mm，長10 cm）顯微鏡、照相機 OLYMPUS微型渦旋混合器：上海滬西分析儀器廠XW-80AImage-Pro Plus6.0專業(yè)圖像分析系統(tǒng)：美國Media Cybernetics公司。

1.4 實驗動物分組及造模

1.4.1 實驗動物及分組 40只家兔適應性飼養(yǎng)1周，測定血脂和體質量，依據(jù)血脂和體質量分為假手術組10只，模型組15只，心腦血脈寧組15只。假手術組飼以普通飼料，模型組：每天每只家兔給予50 g高脂飼料，再以普通飼料補足。心腦血脈寧組：造模完畢1周后，除保持和模型組同樣飼養(yǎng)條件外，參照文獻[3]，家兔灌服心腦血脈寧0.28 g/（kg·d），4周稱量1次體質量，調整藥物劑量，實驗周期為15周。

1.4.2 藥物觸發(fā) 于處死動物前24 h和48 h給予兩次藥物觸發(fā)，藥物觸發(fā)參考文獻[2]的方法：以蝰蛇毒（RVV）0.15mg/kg腹膜下注射，30min后耳緣靜脈注射組胺0.02mg/kg。

1.4.3 實驗動物模型復制 模型組和心腦血脈寧組飼養(yǎng)2周高脂飼料后，行主動脈球囊內皮拉傷術，參照文獻[1]方法進行：戊巴比妥鈉（30mg/kg）耳緣靜脈注射麻醉，固定，備皮。在無菌條件下，于兔股動脈搏動最明顯處皮膚消毒，鋪無菌洞巾，切開皮膚，分離組織，暴露股動脈，結扎遠心端，近心端備用，動脈夾夾住近心端股動脈，靠近遠心端結扎處作一動脈切口并導入4 F無菌球囊導管，放開動脈夾并收緊下方細線，局部壓迫止血，將球囊導管插入15 cm左右，球囊用注射器推注10～15mL空氣，往返回拉球囊3次損傷血管內皮，撤出導管和導絲，結扎股動脈并縫合傷口，術后10萬U/kg青霉素肌注預防感染，連續(xù)7 d。術后繼續(xù)飼以高脂飼料，普通飼料補足。假手術組麻醉固定，備皮，無菌條件下，于兔股動脈搏動最明顯處皮膚消毒，鋪無菌洞巾，切開皮膚，分離組織，暴露股動脈，不作動脈切口，直接縫合皮膚。

1.5 方法

1.5.1 蘇木精-伊紅（HE）染色 處死動物，取出自主動脈根部至髂總動脈分支處的主動脈，剝凈外膜和周圍脂肪，沿腹側正中線縱向剪開，用0.9%的生理鹽水沖洗干凈，平鋪于濾紙上，照相并計數(shù)斑塊破裂情況，隨即用中性甲醛溶液固定24 h以上，在主動脈弓下定位1 cm處，取材制石蠟切片，進行HE染色，光鏡下觀察組織學改變。

1.5.2 易損斑塊家兔模型主動脈斑塊破裂的計數(shù) 在HE然色片中計數(shù)破裂斑塊數(shù)目。破裂的斑塊典型特征是：1）薄的纖維帽。2）較大的脂核。3）較多的炎細胞，特別是巨噬細胞浸潤。

1.5.3 用免疫組化方法檢測MMP-2、TIMP-2蛋白含量 光鏡下每張切片于×400隨機選取5個互不重疊視野，應用Image-Pro Plus6.0專業(yè)圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，測定每個視野的積分光密度值，取其平均值作為每張切片的結果。積分光密度數(shù)值大小反映了應用免疫組化方法所檢測的蛋白表達量的多少。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。結果用均數(shù)±標準差（±s）表示，經正態(tài)性檢驗數(shù)據(jù)成正態(tài)分布，采用單因素方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 兔主動脈病理形態(tài)學觀察 假手術組的動脈內膜平坦完整，內皮細胞連續(xù)，中膜平滑肌排列規(guī)整，與彈力板平行。模型組的斑塊中心可見大量脂質沉積形成的脂核，斑塊表面覆蓋薄的纖維帽，在斑塊肩部可見殘存的泡沫細胞和大量炎細胞浸潤。心腦血脈寧組斑塊中心可見脂質沉積形成的脂核，斑塊表面覆蓋較厚纖維帽，在斑塊肩部少量炎細胞浸潤。

2.2 觀察并計數(shù)斑塊破裂情況 HE染色觀察易損斑塊纖維帽厚度及炎細胞浸潤程度。穩(wěn)定斑塊纖維帽平均厚度為0.44mm，而易損斑塊平均厚度僅為0.13mm。心腦血脈寧對易損斑塊模型家兔，藥物觸發(fā)后，模型組10只家兔中6只10處出現(xiàn)斑塊破裂，而心腦血脈寧組有4只6處出現(xiàn)斑塊破裂。提示心腦血脈寧有穩(wěn)定易損斑塊的作用。

2.3 心腦血脈寧對易損斑塊模型家兔MMP-2/TIMP-2的影響 見表1。

表1 心腦血脈寧對易損斑塊模型家兔主動脈MM P-2、TIMP-2表達影響(±s)Tab.1 Effectof Xinnao Xuemaining on expression of MMP-2 and TIMP in vulnerable plaque of rabbitwith atherosclerosis(±s)

表1 心腦血脈寧對易損斑塊模型家兔主動脈MM P-2、TIMP-2表達影響(±s)Tab.1 Effectof Xinnao Xuemaining on expression of MMP-2 and TIMP in vulnerable plaque of rabbitwith atherosclerosis(±s)

注：與假手術組比較 ##P＜0.01；與模型組比較 *P＜0.05，**P＜0.01。

組別假手術組模型組心腦血脈寧組10 MMP-2/TIMP-2 0.88±0.08 1.22±0.19##0.97±0.19*n 9 1 0 MMP-2光密度值（IOD）3864.56±821.14 10395.76±2003.92##7484.13±1115.37**TIMP光密度值（IOD）4 286.21±766.87 8 862.35±1 808.99##7 605.04±2 278.55

模型組MMP-2、TIMP-2蛋白含量明顯升高，與假手術組相比，差異有顯著性（P＜0.01）；心腦血脈寧組MMP-2與模型組比較表達降低，差異有顯著性（P＜0.01），而TIMP-2含量與模型組相比有降低趨勢，但差異無顯著性（P＞0.05）；心腦血脈寧組能夠有效降低兩者比值，與模型組相比差異有顯著性（P＜0.01）。

3 討論

中藥復方“心腦血脈寧片”（生黃芪、當歸、川芎、赤芍、水蛭）為天津中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院的院制劑，批準文號：津藥制（字）2001ZD0346號，出自清朝王清任的《醫(yī)林改錯》中“補陽還五湯”。補陽還五湯由黃芪、當歸、赤芍、川芎、紅花、桃仁和地龍組成，用以治療氣虛血瘀為主的病證。

在動物體內復制AS動物模型方法較多且都比較成熟，但復制易損斑塊破裂模型卻非常困難，這主要與影響斑塊破裂的因素多有關。目前建立斑塊破裂方法主要有兩類：1）尋找自發(fā)斑塊破裂/血栓形成動物模型。2）主動誘發(fā)斑塊破裂/血栓形成動物模型。本實驗參照Ab ela等方法采用了球囊拉傷配合高脂飼料，復制易損斑塊動物模型，周期較短，易于制作和成功，在目前缺乏AS斑塊破裂動物模型“金標準”情況下，可較好地用于斑塊破裂發(fā)生機制和篩選穩(wěn)定斑塊藥物研究。

ACS多數(shù)是由于易損斑塊破裂，導致局部血栓形成而造成血管閉塞或不完全閉塞。因此穩(wěn)定斑塊對防治ACS至關重要[3]。本實驗通過對斑塊破裂的計數(shù)，得出心腦血脈寧可以穩(wěn)定易損斑塊；HE染色結果提示，假手術組鏡下結構完整，模型組在易損斑塊肩部有大量炎細胞浸潤，心腦血脈寧組炎細胞數(shù)目較模型組減少。此外，心腦血脈寧還能夠通過增加易損斑塊纖維帽厚度，增強易損斑塊穩(wěn)定性。

基質金屬蛋白酶（MMPs）是能夠降解細胞外基質，參與降解包括骨在內的全身各種組織細胞外基質的蛋白酶家族[4]，MMP-2主要由成纖維細胞、炎癥細胞、心肌細胞等細胞合成與分泌[5]，易損斑塊內聚集著大量炎性細胞，特別是巨噬細胞，可產生大量MMPs，降解纖維帽下的基質成分，使纖維帽變薄，易于破裂。TIMP-2可抑制MMP-2的活性，從而影響整個MMPs/TIMPs系統(tǒng)。TIMP通過阻礙MMP介導的內皮細胞移動，抑制基質中促血管生成因子的釋放而使MMPs的降解作用局限化，因此MMPs與TIMPs相互之間的作用平衡，對動脈粥樣硬化易損斑塊的發(fā)展方向起著重要的作用[6]。本實驗觀察心腦血脈寧MMP-2，TIMP-2的表達，結果：心腦血脈寧可能通過降低細胞外基質中MMP-2表達，調整MMP-2/TIMP-2比值，說明心腦血脈寧可以適度地調節(jié)MMP活性，改善細胞外基質重構，減輕基質降解，增加斑塊纖維帽的穩(wěn)定性，穩(wěn)定斑塊。

[1]徐 浩,陳可冀.從對動脈粥樣硬化認識轉變看中西醫(yī)結合的優(yōu)勢與切入點[J].中國中西醫(yī)結合雜志,2007,27(1):5-7.

[2]梁 春,黃高忠,吳宗貴.穩(wěn)定斑塊-治療急性冠狀動脈綜合征的新策略[J].中華老年心腦血管病雜志,2000,2(3):207-210.

[3]馬煥云.動脈粥樣硬化易損斑塊的研究進展[J].新醫(yī)學,2006,37(10):692-699.

[4]吳 旻,李玉光,閆純英.基質金屬蛋白酶和氧化應激在大鼠動脈粥樣硬化中的表達[J].中國心血管病研究雜志,2007,5(1):55-57.

[5]周憲梁,孫 凱,李昭暉.基質金屬蛋白酶與動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生、發(fā)展的關系[J].中國比較醫(yī)學雜志,2006,16(12):705-707.

[6]周一軍,張 錦,李 莉,等.糖尿病患者動脈粥樣硬化斑塊內基質金屬蛋白酶2和9與斑塊穩(wěn)定的關系[J].中國動脈硬化雜志,2005,13(1):69-72.

Expression ofMMP-2,TIMP-2 of vulnerable plaque in rabbitswith atherosclerosis treated with Xinnao Xuemaining

GUOMao-juan，MADong-ming，LUBin，atel
(Pathology Laboratory of Tianjin University of TCM，Tianjin 300193,China)

[Objective]Toobserve the effectsof Xinnao Xuemaining on theexpression ofMMP-2,TIMP-2 of vulnerable plaque in rabbits with atherosclerosis.[Methods]The vulnerable atherosclerotic plaquemodelwas reproduced by operation on abdominalaorta endothelium for inducing sacculus pull injury with the foraging with high cholesterol lipid feeding.Rats were divided into three groups:model group,sham operation group and Xinnao Xuemaining group.The experiment lasted for 15 weeks.After killing at the end of experiment,the sample ofabdominalaortawas collected for HE staining andmicroscopic lesion examination,counting of the number of plaque rupture and detecting the protein content of MMP-2,TIMP-2 by immunohistochemistry.[Results]HE observation was found that in the sham-operated group themorphologic structure was intact.In the center ofmodel group a large number of lipid plaque coreswas seen.The plaquewas covered with fibrous cap,the shoulder patcheswere visible in the remnants of foam cells and large inflammatory cell infiltration exited.In Xinnao Xuemaininggroup thenumberof lipid plaque coreswasbetweenmodeland sham operation group.The results of immunohistochemicalstaining showed thatcompared with sham-operated group,the expression ofMMP-2,TIMP-2 inmodelgroup was significantly increased(P<0.01).Comparedwithmodelgroup theexpression ofMMP-2 in Xinnao Xuemaininggroup reduced significantly(P<0.01).The TIMP-2 levelswee lower,but therewasno statisticaldifference(P>0.05).Xinnao Xuemaining group can effectively reduce both the ratio ofMMP-2/TIMP-2 compared withmodelgroup(P<0.01).[Conclusion]In vulnerable plaque ofatherosclerotic rabbitmodel Xinnao Xuemaining group can reduce the plaque rupture,itsmechanismmay be related to reducing the expression ofMMP-2 and regulating the ratio ofMMP-2 and TIMP-2.

Xinnao Xuemaining;vulnerable plaque;MMP-2;TIMP-2

R285.5

A

1672-1519(2010)02-0150-03

天津市衛(wèi)生局中西醫(yī)結合專項基金的資助項目（023611611）。

郭茂娟（1980-），女，碩士，研究方向為中西醫(yī)結合防治心腦疾病。

姜希娟。

2009-12-24）