李廣斌，蘇金玲，姜希娟，范英昌

（天津中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津 300193）

心復(fù)康聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對瀕死心肌的保護作用*

李廣斌，蘇金玲，姜希娟，范英昌

（天津中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津 300193）

[目的]探討中藥心復(fù)康聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）移植在大鼠急性心肌梗死后對瀕死心肌的保護作用及其機制。[方法]經(jīng)密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選法培養(yǎng)并純化BMSCs，采用冠狀動脈結(jié)扎法建立大鼠急性心肌梗死模型，移植前以5-溴脫氧尿核苷（Brdu）對移植細(xì)胞進行標(biāo)記，術(shù)后采用中藥心復(fù)康灌胃聯(lián)合干細(xì)胞移植治療。治療后2周處死動物，免疫組織化學(xué)方法檢測心肌損傷區(qū)Brdu陽性移植細(xì)胞數(shù)、CD34+新生血管數(shù)和細(xì)胞增殖核抗原（PCNA）陽性心肌細(xì)胞數(shù)量。[結(jié)果]心復(fù)康聯(lián)合干細(xì)胞移植治療組移植細(xì)胞存活率增加（與細(xì)胞移植組比較P<0.05），梗死邊緣區(qū)新生血管數(shù)量及PCNA陽性心肌細(xì)胞數(shù)量均有所增加（與細(xì)胞移植組比較P<0.05）。[結(jié)論]中藥心復(fù)康聯(lián)合干細(xì)胞移植對大鼠急性心肌梗死后瀕死心肌細(xì)胞有明顯的保護作用，其機制可能與心復(fù)康聯(lián)合干細(xì)胞移植能更有效的促進損傷區(qū)血管新生有關(guān)。

心復(fù)康；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；心肌梗死；血管新生

最近，中藥聯(lián)合骨髓干細(xì)胞移植治療心肌梗死取得了令人鼓舞的進展，顯示出中藥在干細(xì)胞移植過程中存在的特有優(yōu)勢：毒副作用小，促進干細(xì)胞增殖、分化等[1-2]。本實驗采用中藥心復(fù)康干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療實驗性大鼠心肌梗死，以觀察中藥心復(fù)康聯(lián)合干細(xì)胞移植對大鼠心肌梗死后梗死周邊區(qū)域心肌的保護作用，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量150～250 g（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院第四研究所動物實驗中心）,LDMEM培養(yǎng)基（美國GIBCO公司），胎牛血清（FCS，美國Hyclone公司），胰蛋白酶（Difco），乙二胺四乙酸（EDTA，天津聯(lián)星試劑公司），5-溴脫氧尿核苷BrdU（Sigma公司），CD34、細(xì)胞增殖核抗原（PCNA）免疫組化試劑盒（天津聯(lián)星試劑公司），BrdU石蠟切片免疫組化試劑盒（天津市灝陽生物制品有限公司），中藥心復(fù)康（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室）。

1.2方法

1.2.1 BMSCs體外分離培養(yǎng)和BrdU標(biāo)記 本實驗采用密度梯度離心和貼壁篩選法培養(yǎng)并純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），該方法可獲得較純的BMSCs，Pittenger等用流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)的第1代、第2代BMSCs的均質(zhì)性分別達到95%和98%[3]。

5-溴脫氧尿核苷（BrdU）標(biāo)記：每日觀察原代及傳代的細(xì)胞生長狀況，需加BrdU的培養(yǎng)瓶中預(yù)先加入0.5 cm×1.0 cm無菌玻片，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底50%時加入BrdU溶液10μmol/L（BrdU 50mg；二甲基亞砜 0.8mL；水 1.2m L）分別孵育 24、48、72、96 h。取出玻片，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，4%多聚甲醛固定15min，進行Brdu免疫組化染色（嚴(yán)格按試劑盒說明進行）。

1.2.2 動物模型制備 同基因型雄性Wistar大鼠，190～210 g，乙醚吸入麻醉。頸部正中切口，插入氣管套管，行呼氣末正壓通氣，標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)記錄心電圖。在胸部左側(cè)約0.5 cm處第4、5肋間切開皮膚，鈍性剝離肌肉層，剪開心包，暴露心臟，以左冠狀動脈主干為標(biāo)志，在左心耳根部下方2mm處用無創(chuàng)小圓針結(jié)扎左冠狀動脈前降支。手術(shù)15min，心電圖S-T段呈單向曲線，術(shù)后兩周蘇木精-伊紅（HE）染色見明確梗死區(qū)示手術(shù)成功。

1.2.3 BMSCs移植 移植前48 h在培養(yǎng)液中加入終濃度為10μmol/L的Brdu對移植細(xì)胞進行標(biāo)記。胰酶消化，PBS 反復(fù)沖洗、離心（1 500 r/min，5min）2次，加入PBS液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個/L。治療組手術(shù)結(jié)扎冠狀動脈15min后，再次打開胸腔，暴露心臟，用結(jié)核菌素注射器吸取1mL細(xì)胞懸液，分別于結(jié)扎區(qū)和附近心肌組織分5點注射細(xì)胞，對照組和模型組注射相同劑量生理鹽水，注射完畢后，關(guān)閉胸腔，并注射2 d青霉素。

1.2.4 動物分組 實驗分為4組：假手術(shù)組（S組，n=10）：只開胸穿線，不結(jié)扎左冠狀動脈前降支。模型組（AMI組，n=10）：開胸結(jié)扎左冠狀動脈前降支。單純細(xì)胞移植組（B 組，n=10）：手術(shù)后 15min，注射培養(yǎng)的BMSCs。中藥聯(lián)合細(xì)胞移植組（X+B組，n=10）：手術(shù)后15min移植培養(yǎng)的BMSCs，并按體表面積法計算中藥劑量的10倍[81 g/（kg·d）]灌胃2周。

1.2.5 中藥制備 將中藥心復(fù)康（由西洋參、白術(shù)、枸杞子、女貞子、土鱉蟲等組成）置于砂鍋中，加入相當(dāng)于藥材體積5倍的自來水浸泡1～2h，煮沸30min，濾過藥液，再加入3倍量的自來水繼續(xù)煮沸20min，過濾，合并兩次濾液，將藥物濃縮至200mL備用。

1.3 指標(biāo)檢測 進行移植細(xì)胞存活率、新生微血管密度及PCNA陽性心肌細(xì)胞數(shù)檢測。處死動物，以結(jié)扎線為標(biāo)志，每隔3mm取大鼠心臟橫斷面，每只大鼠心臟取材3塊組織，制成切片，免疫組織化學(xué)方法檢測心梗區(qū)Brdu陽性移植細(xì)胞數(shù)、CD34+新生血管數(shù)和PCNA陽性心肌細(xì)胞數(shù)（操作按試劑盒說明進行）。Nikon光學(xué)顯微鏡400倍視野下,每個組織切片隨機選取10個視野,取10個視野平均值。移植細(xì)胞計數(shù)Brdu（＋）細(xì)胞，CD34陽性的血管計數(shù)時，相互分離的內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞簇、內(nèi)皮細(xì)胞條索均按1個微血管計數(shù)，管腔大于8個紅細(xì)胞大小，且?guī)в休^厚肌層的血管則不予計數(shù)；計算PCNA陽性率時,光鏡下沒有細(xì)胞質(zhì)的增殖核,不計算在PCNA陽性率之中[4]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，均數(shù)比較采用t檢驗。

2 實驗結(jié)果

2.1 BMSCs分離和培養(yǎng) 分離接種的細(xì)胞鏡下呈圓形，大小不一，數(shù)目較多，48 h后貼壁，8～9 d后大部分細(xì)胞變成長梭形，少部分呈多角形。此期的細(xì)胞生長迅速，互相連接。傳代培養(yǎng)2～3代后，細(xì)胞形態(tài)變得較為一致，呈紡錘形、梭形、多角形，增殖迅速，集落之間相互靠近，融合后呈漩渦狀。至培養(yǎng)的第12天左右細(xì)胞達到80%～90%融合，此時已傳至第3代，細(xì)胞形態(tài)成較一致的長梭形。將此時細(xì)胞收集用于細(xì)胞移植實驗。

2.2 BMSCs標(biāo)記 骨髓間充質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)至40%～50%貼壁時加BrdU，在培養(yǎng)過程中，BMSCs呈紡錘形,可以貼壁生長、增殖。第8天,培養(yǎng)瓶中幾乎所有的細(xì)胞都呈紡錘形的間充質(zhì)干細(xì)胞。各標(biāo)記組均見BrdU陽性細(xì)胞，Brd U陽性反應(yīng)物位于細(xì)胞核，呈棕色、顆粒狀或彌漫性分布。各組觀察200個細(xì)胞，記錄Brd U陽性細(xì)胞的數(shù)目。結(jié)果可見標(biāo)記24、48、72 h各組之間細(xì)胞陽性數(shù)明顯增加，筆者選用標(biāo)記72 h作為最佳標(biāo)記時間進行后續(xù)實驗，標(biāo)記率＞96%，能夠滿足實驗需要。

2.3 各組大鼠梗死區(qū)域BrdU陽性移植細(xì)胞檢查結(jié)果 與細(xì)胞移植組比較，心復(fù)康聯(lián)合細(xì)胞移植組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)有所增加（P<0.05），見表1。

表1 各組大鼠Brdu陽性細(xì)胞數(shù)的比較(±s)Tab.1 Com parison of cellamountof Brdu+in ratsof each group(±s)

表1 各組大鼠Brdu陽性細(xì)胞數(shù)的比較(±s)Tab.1 Com parison of cellamountof Brdu+in ratsof each group(±s)

注：與細(xì)胞移植組比較★P<0.05。

組別B組X+B組n 10 10個/高倍視野7.40±1.52 8.76±2.38★

2.4 各組大鼠梗死周邊區(qū)域新生血管及PCNA陽性心肌細(xì)胞檢查結(jié)果 與假手術(shù)組比較，各組PCNA陽性心肌細(xì)胞數(shù)量和新生血管數(shù)量均升高（P<0.01）；與模型組比較，單純移植組PCNA陽性心肌細(xì)胞數(shù)量無統(tǒng)計學(xué)差異，心復(fù)康聯(lián)合干細(xì)胞移植組PCNA陽性心肌細(xì)胞和新生血管數(shù)量升高，（P<0.05）；與移植組比較，心復(fù)康聯(lián)合干細(xì)胞移植組PCNA陽性心肌細(xì)胞數(shù)及新生血管數(shù)量升高（P<0.05）。見表 2。

表2 各組大鼠PCNA陽性心肌細(xì)胞數(shù)量和新生血管數(shù)量的比較(±s)Tab.2 Com parison of cardiacmuscle amountof PCNA+and neonatalvesselsof cd34+in ratsof each group(±s)

表2 各組大鼠PCNA陽性心肌細(xì)胞數(shù)量和新生血管數(shù)量的比較(±s)Tab.2 Com parison of cardiacmuscle amountof PCNA+and neonatalvesselsof cd34+in ratsof each group(±s)

注：與假手術(shù)組比較※P<0.05，※※P<0.01 與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01；與細(xì)胞移植組比較★P<0.05。

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3 討論

筆者的實驗采用PCNA標(biāo)記細(xì)胞的增殖，PCNA是酸性核蛋白，作為增殖細(xì)胞核抗原是真核細(xì)胞DNA合成所必須的一種核蛋白，PCNA在正常成年動物的心肌組織中沒有表達，而在未成熟心肌和晚期衰竭心肌中有陽性表達[4]。

筆者的實驗評價了不同處理方法后各實驗組細(xì)胞增殖情況的差別，從結(jié)果來看聯(lián)合治療組PCNA陽性細(xì)胞數(shù)較模型組有所升高，并且大多數(shù)細(xì)胞形態(tài)接近于血管內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞，其中,在梗死區(qū)及其邊緣,大量的間質(zhì)細(xì)胞PCNA陽性表達反映了血管新生和瘢痕形成。

從實驗結(jié)果看，各治療組均有PCNA陽性的心肌細(xì)胞出現(xiàn)，單純細(xì)胞移植組PCNA陽性細(xì)胞數(shù)與模型組比較沒有明顯增多，而中藥聯(lián)合細(xì)胞移植組PCNA陽性心肌細(xì)胞數(shù)要多于單純細(xì)胞移植組，說明中藥在促進心肌細(xì)胞PCNA陽性表達方面占有優(yōu)勢。

筆者認(rèn)為中藥促進心肌細(xì)胞的修復(fù)和增殖中可能基于以下機制：一方面，心復(fù)康中的主要成分能夠促進梗死周邊區(qū)域血管新生，從而改善該區(qū)域血供，實驗證實，聯(lián)合治療組新生血管數(shù)要高于單純細(xì)胞移植組和模型組（P<0.05）。另一方面，心復(fù)康中主要成分如西洋參具有改善心功能，增加免疫，抗應(yīng)激的作用，所含的皂苷有抗心律失常，抗心肌缺血，抗心肌氧化的作用；川芎所含的川芎嗪有保護心肌缺血損傷，降低心肌耗氧量的作用；丹參活血化瘀，所含的丹參酮ⅡA，有改善心肌缺血，對心肌梗死有保護作用，并能改善微循環(huán)。

心肌梗死屬于中醫(yī)“胸痹”“厥心痛”的范疇?！督饏T要略》認(rèn)為胸痹心痛的病機為“陽微陰弦”本虛標(biāo)實。中藥復(fù)方心復(fù)康以益氣養(yǎng)陰，活血化瘀為根本大法，方中西洋參甘寒之品，補氣養(yǎng)陰、清火生津；鹿銜草甘溫補陽，微補腎陽、健脾理氣；女貞子辛苦清涼，補中有清，滋而不膩，為補益肝腎之良藥；丹參擅長活血化瘀，為活血化瘀的常用藥；川芎味薄而氣清，為陰中之陽，故能行血中之氣；土鱉蟲具破血逐瘀之力，其力猛而性溫和。全方扶正祛邪，調(diào)和氣血運行，從而使正勝邪去，氣血盈暢，達到病去人安。筆者的實驗證實心復(fù)康對移植BMSCs存在一定保護作用，其機制可能與促進心肌損傷區(qū)血管新生有關(guān)，這一結(jié)果為中藥聯(lián)合BMSCs移植治療心肌梗死提供了一定的實驗依據(jù)。

[1]盧新政,張曉友.人參皂苷Rg1對培養(yǎng)豬骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響[J].中國藥理學(xué)通報,2003,19(3):353-354.

[2]祝曉玲,祝彼得.黃芪體外作用對貧血小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌SCF的影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2002,18(4):396-397.

[3]Pittenger C.,PittengerM.F.,Cahill K.S.,etal.Human Mesenchymal Stem Cells Differentiate to a Cardiomyocyte Phenotype in the Adult Murine[J].HeartCirculation,2002，105(1):93-98.

[4]李 灝,何建國.心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞增殖與心功能的關(guān)系研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2006，86（2）：102-105.

Protective action on im pending death cardiacmusclesby the therapy of traditionalChinesemedicine XinFuKang combined with transp lanted bonemesenchymalstem cells

LIGuang-bin， SU Jin-ling，JIANGXi-juan
（Tianjin University of TraditionalChineseMidicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]To discuss the protective action on impending death cardiacmusclesby the therapy of traditionalChinesemedicine XinFuKang(XFK)combined with transplanted Bonemesenchymal stem cells（BMSCs） after rats acutemyocardial infarction.[Methods]BMSCswere cultured and purified by gradientcentrifugation-adhesivemethod.The ratswith acutemyocardial infarction were builted by coronary artery ligation.Before transplation,BMSCs were signed by Brdu,and after the OPS.of coronary artery ligation,the therapy methodewas XFK combining BMSCs transplantation.After2weeks,wemeasured cellamountof Brdu,neonatalvesselsofCD34 and the cardiacmuscle of PCNA around the infarctarea bymethod of IHC.[Results]Themethod of XFK combining BMSCs transplantation can increase livability of transplanted BMSCs,enhance the amount of neonatal vessel and PCNA cardiacmuscle around infarctarea(compared with group of BMSCs tranplation,P<0.05).[Conclusion]The therapy of XFK combined with BMSCs transplantation have better protection on the impending death cardiacmusclesaround the infarctarea,themechanism maybe the therapy can promote the vessels regeneration.

XinFuKang；BMSCs；Myocardial infarction；Vessel regeneration

R285.5

A

1672-1519(2010)01-0147-03

天津市衛(wèi)生局中西醫(yī)結(jié)合科研基金項目（03035）。

李廣斌（1975-），男，碩士，講師，主要從事心血管疾病研究及教學(xué)工作。

范英昌。

2009－08－20）