杜曉寧,宋明鳴,趙 誠,徐建飛

(上?；ぱ芯吭?上海 200062)

13C-尿素是重要的13C標(biāo)記基礎(chǔ)試劑之一,其最為廣泛的應(yīng)用是臨床診斷用13C-尿素呼氣試驗(13C-UBT)[1-2]。目前13C-UBT在臨床上用于檢測胃幽門螺旋桿菌(Helicobacter Pylori,HP)感染在國際上已被公認為胃部 HP感染診斷的最重要手段之一,并被譽為胃部 HP感染診斷的金標(biāo)準。近十幾年來,醫(yī)學(xué)領(lǐng)域在以最小劑量的13C-尿素獲得高敏感性檢測方面做了大量工作,有文獻認為最小劑量為25 mg[3];另有文獻認為,用中等豐度的13C-尿素可以縮短試劑制備周期,降低生產(chǎn)成本[4]。在分析檢測方面,研究13C同位素比值的測定比較多[5],而高豐度13C-尿素的同位素豐度的檢測技術(shù)鮮有報道。1996年Tetsuya Tamgawa[6]用HPLC-APCIMS檢測13C-尿素的豐度取得進展;2004年劉東陽等針對國內(nèi)尚無13C-尿素的同位素豐度定量檢測方法,研究了用LC-MS檢測13C-尿素同位素豐度的方法,探索了13C-UBT診斷試劑13C-尿素的定量依據(jù);高效液相色譜法測定呼氣試劑盒中13C-尿素的含量及質(zhì)譜法測定13C-尿素的同位素豐度[7-8]都是為了更好地控制呼氣試劑中13C同位素的有效含量,以保證13C-UBT的高靈敏度和特異性。因此,為了更好地開展13C-UBT試驗,有必要建立一個能夠?qū)Ω哓S度13C-尿素的同位素豐度準確定量的方法。

本工作擬選擇合適的樣品轉(zhuǎn)化處理方法和實驗條件將13C-尿素樣品轉(zhuǎn)化為13CO2,以13CO2氣體為樣品,用氣體同位素質(zhì)譜計分析13C-尿素的同位素豐度。與其它類型質(zhì)譜分析方法不同,氣體同位素質(zhì)譜采用成分簡單且純度較高的氣體為樣品氣,避免了進樣成分為尿素或其衍生物而引進N、H等元素的同位素干擾,具有準確度好、精確度高的特點。

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

MA T-271氣體同位素質(zhì)譜計:美國 Finnigan質(zhì)譜公司;高溫電阻爐(又名馬弗爐):上海實驗儀器廠;玻璃真空系統(tǒng):自制,真空度1×10-2Pa;13C-尿素:美國 CIL公司,同位素豐度99.1%),13C-尿素:上海化工研究院,同位素豐度97.5%±0.1%,90.7%±0.1%;亞硝酸鈉(分析純)和氧化銅(化學(xué)純)均為國產(chǎn)試劑。

1.2 實驗方法

13C-尿素樣品經(jīng)過轉(zhuǎn)化處理生成13CO2氣體,將生成的13CO2氣體送入氣體同位素質(zhì)譜計檢測系統(tǒng),用質(zhì)譜法測定其13C豐度。

1.2.1 樣品轉(zhuǎn)化原理

樣品轉(zhuǎn)化有2種方法,一種為氧化法,一種為高溫灼燒法。

氧化法轉(zhuǎn)化是亞硝酸鹽與尿素在酸性條件下反應(yīng),其化學(xué)反應(yīng)式[9]如下:

高溫灼燒法是以真空樣品管內(nèi)的氧化銅作為供氧劑,尿素在高溫下發(fā)生氧化反應(yīng),其化學(xué)反應(yīng)式如下:

1.2.2 樣品制備方法

氧化法:稱取2～3 mg13C-尿素樣品和2～3 mg亞硝酸鈉試劑,使其質(zhì)量比約為1∶1。將樣品和試劑放入專用雙球反應(yīng)管[10]的直管底部,再在雙球反應(yīng)管的支管中加入1～2 mL 6 mol/L的硫酸溶液,用進樣連接器接入樣品轉(zhuǎn)化真空系統(tǒng),并抽真空,至溶液中溶解的空氣被除去(用手觸摸反應(yīng)管的球泡部明顯感覺溫度降低),此時可將進樣連接器的旋塞閥關(guān)閉。將反應(yīng)管及進樣連接器從真空系統(tǒng)取下,把反應(yīng)支管球泡里的硫酸溶液傾斜倒入盛放固體樣品和試劑的球泡,使兩球泡中的液固體接觸進行反應(yīng),用約60℃的熱水加熱反應(yīng)管,并不停晃動以使反應(yīng)進行完全。產(chǎn)生的13CO2氣即可作為測定13C豐度的樣品氣。

高溫灼燒法:稱取1～1.2 mg13C-尿素樣品,10～15 mg氧化銅,少量新鮮銅絲,放入玻璃樣品管[11],接入真空系統(tǒng)抽除空氣,與此同時用煤氣噴燈烘烤樣品管壁去除吸附的氣體,至真空度低于1×10-2Pa時熔燒取下樣品管。將制備好的樣品管放入馬弗爐,530℃灼燒3 h,自然降溫至200℃以下,取出待用。

1.2.3 儀器條件

MA T271氣體同位素質(zhì)譜計工作條件:離子源發(fā)射電流為 0.040 mA,電子能量為98.60 eV,阱電壓為133.15 V;離子源溫度為160℃;高壓為10 k V;接收器為法拉弟筒。

1.2.4 樣品測定

氧化法:把制得的樣品氣經(jīng)過液氮冷凍并接入質(zhì)譜計真空系統(tǒng)抽真空,除去樣品氣中含有的氮氣,關(guān)閉進樣連接器的旋塞閥,用冷水將球泡化凍,再將球泡浸入用酒精液氮調(diào)制的-50～-60℃冷凍液中數(shù)分鐘。檢測條件:在質(zhì)譜計的真空度低于2×10-5Pa時將球泡中的13CO2氣體引入質(zhì)譜計進樣系統(tǒng),儲樣系統(tǒng)壓力約為10 Pa。

高溫灼燒法:將樣品管接入質(zhì)譜計真空進樣系統(tǒng),待儀器具備檢測條件時,將樣品管的毛細管部分破碎,待測氣體被引入質(zhì)譜計的進樣系統(tǒng),至儲樣系統(tǒng)壓力約為10 Pa。

2 結(jié)果與討論

2.1 氧化法

2.1.1 硫酸溶液濃度

在尿素轉(zhuǎn)化生成CO2的反應(yīng)中,氧化劑是亞硝酸?？紤]到亞硝酸極不穩(wěn)定,采取在反應(yīng)體系內(nèi)用酸與亞硝酸鹽作用生成亞硝酸再與尿素反應(yīng)生成CO2的方法。在本實驗中選用的是對系統(tǒng)干擾較小的硫酸,并比較了不同硫酸濃度對反應(yīng)的影響,結(jié)果列于表1。由表1可知,硫酸的濃度為2.25、4.50和9.0 mol/L都可以滿足反應(yīng)的要求,但在實驗中如果酸濃度較低,會延長反應(yīng)時間,掌握不好會因為反應(yīng)不完全而造成數(shù)據(jù)偏差較大;硫酸濃度大于9.00 mol/L時,液體粘度增大,易粘附在反應(yīng)管壁造成浪費,所以實際操作時可選擇酸的濃度比表3中的濃度略大一些,更有利于反應(yīng)較快完成。

表1 不同硫酸濃度下生成的CO2氣體的13 C豐度(s,n=6)

表1 不同硫酸濃度下生成的CO2氣體的13 C豐度(s,n=6)

硫酸濃度/mol·L-1 13C豐度/%9.00 99.07±0.06 4.50 99.05±0.07 2.25 99.04±0.15

2.1.213C-尿素最小樣品量的確定

13C-尿素價格不菲,所以,在研究檢測方法時以最小的樣品量制備得到足夠供質(zhì)譜分析的氣體并得到可信度高的分析結(jié)果是實驗的目的之一。為此,安排了兩組實驗,結(jié)果分別列于表2和表3。

由表2可知,樣品用量2～5 mg都可以滿足樣品轉(zhuǎn)化的要求。對這組數(shù)據(jù)的精密度做統(tǒng)計檢驗可得 f=3.062 5,置信水平α=0.05時,F(0.05)(4,4)=6.39。此數(shù)據(jù)表明,表2中不同樣品量所測結(jié)果沒有顯著差異。

表2 最低樣品量實驗,n=5)

表2 最低樣品量實驗,n=5)

樣品量/mg 13C豐度/%2 97.51±0.05 3 97.52±0.05 4 97.51±0.04 5 97.51±0.07

為了考察2～3 mg樣品量在儀器檢測時隨機進樣的線性范圍,以及檢測結(jié)果的準確度,進行了不同進樣量與特征峰積分強度的相關(guān)性實驗。具體操作:稱5 mg樣品,用亞硝酸氧化法處理,將樣品轉(zhuǎn)化系統(tǒng)接入質(zhì)譜進樣系統(tǒng),控制氣體進樣量(以儀器儲樣球的壓力表示),連續(xù)分別進樣,檢測進樣壓力為9～20 Pa的結(jié)果,數(shù)據(jù)列于表3。

表3 不同進樣量與峰積分強度的相關(guān)系數(shù)

對表3的兩組數(shù)據(jù)進行線性回歸,結(jié)果示于圖1和圖2。由圖1和圖2可知,儀器進樣壓力為9～20 Pa時,氣體進樣量與 m/z=44峰強的相關(guān)方程為 y=2.212x+0.465,r=0.997 1,與m/z=45峰強的相關(guān)方程為 y=245.41 x+34.223,r=0.999 9。

由表3可知5 mg樣品產(chǎn)生的氣體在儀器儲樣球內(nèi)的壓力大于50 Pa,進樣量為9 Pa即可得到滿意的檢測結(jié)果。由此,不僅可以確定最小樣品消耗量為2 mg,而且,每次轉(zhuǎn)化得到的樣品氣在控制進氣量的條件下,可以滿足兩次以上重復(fù)進樣。從表3的檢測結(jié)果還可以看出,同次轉(zhuǎn)化的樣品,分別多次進樣得到的數(shù)據(jù)重復(fù)性很好,同時也表明檢測樣品時儀器的穩(wěn)定性很好。

圖1 進樣壓力與 m/z=44峰的相關(guān)性

圖2 進樣壓力與 m/z=45峰的相關(guān)性

2.1.3 重復(fù)性實驗

用豐度為90.7%的13C-尿素樣品進行樣品轉(zhuǎn)化和儀器檢測的重復(fù)性實驗,結(jié)果列于表4。由表4可以看出,樣品轉(zhuǎn)化方法的重復(fù)性較好,儀器檢測的重復(fù)性也令人滿意。實驗表明,樣品轉(zhuǎn)化的反應(yīng)速度較快,但要保證其完全反應(yīng)還需要有一定的反應(yīng)時間,一般控制反應(yīng)時間1～2 min,樣品管內(nèi)無黃色氣體,液體沒有反應(yīng)氣泡產(chǎn)生即可進行質(zhì)譜檢測。

表4 樣品轉(zhuǎn)化和儀器檢測的重復(fù)性

2.2 高溫灼燒法

含碳有機物在高溫下分解生成的CO2是質(zhì)譜檢測同位素豐度的可用氣體,尋求最適合的溫度、反應(yīng)時間、反應(yīng)所需氧的量和處理方法等是非常必要的。

2.2.1 溫度條件試驗

用豐度為99.1%的13C-尿素樣品進行樣品轉(zhuǎn)化的溫度實驗,結(jié)果列于表5。由表5數(shù)據(jù)可以看出,用高溫灼燒法轉(zhuǎn)化樣品,530～950℃的轉(zhuǎn)化溫度下,反應(yīng)效果沒有明顯差異。由于在較低溫度下反應(yīng)可以選擇普通玻璃制作樣品管,也便于燒結(jié),因此選擇530℃作后續(xù)條件實驗。由實驗可知:反應(yīng)時間無需太長,包括升溫在內(nèi)3 h比較合適。

表5 樣品轉(zhuǎn)化溫度的試驗

2.2.2 氧化銅的凈化處理

氧化銅試劑在真空制備的樣品管中提供氧化反應(yīng)所需的微量氧氣,但是由于微量存在的堿式碳酸銅在高溫時也發(fā)生分解反應(yīng),生成天然豐度的CO2,對檢測13C豐度會產(chǎn)生同位素稀釋效應(yīng),所以,實驗過程應(yīng)考慮對氧化銅試劑進行前處理,用加熱灼燒的方法分解氧化銅試劑表面的堿式碳酸銅,即在280～300℃的馬弗爐里烘燒2 h后使用。實驗中選用了2個不同豐度的13C-尿素樣品驗證氧化銅凈化處理的效果,結(jié)果列于表6。由表6可以看出,對氧化銅進行前處理和不進行處理,13C豐度的檢測結(jié)果有明顯差異。處理過的氧化銅,其檢測結(jié)果也不理想,這是由于使用的氧化銅是用研缽粉碎的,其粒度不夠細,因此在530℃反應(yīng)時顆粒內(nèi)部的堿式碳酸銅進一步分解仍然對樣品檢測造成影響?；诖?用同樣方法制備空白樣品,在檢測中扣除氧化銅試劑的影響,由表 6可知,校正后,結(jié)果比較理想。

2.2.3 樣品與氧化銅的使用量

由表6可知:即使是經(jīng)過處理的氧化銅在高溫灼燒時仍然會生成極少量的CO2,對樣品的13C豐度檢測產(chǎn)生同位素稀釋效應(yīng)。因此,氧化銅用量的控制也很重要。由實驗可知:選用粒徑0.1～0.5 mm的氧化銅,并控制其與樣品的質(zhì)量比為10∶1較宜。

表6 氧化銅的條件實驗

2.3 計算方法的討論

CO2氣體分子由兩種元素構(gòu)成,其中 C原子有2種穩(wěn)定性同位素:12C和13C;O原子有3種穩(wěn)定性同位素:16O、17O、18O。按照排列組合,氣體CO2的同位素分子可有12種形式。在13C的同位素豐度大于90%時,CO2分子的主要構(gòu)成為12C16O16O(m/z=44)、13C16O16O(m/z=45)、12C16O18O(m/z=46)、13C16O18O(m/z=47),m/z為46、47的峰在低分辨質(zhì)譜檢測時會受到其它未知峰的干擾,造成檢測結(jié)果較大的偏差,而實際上高豐度的13CO2中相對分子質(zhì)量46、47的分子只有0.04%～0.4%,因此,可以在計算13C同位素豐度時忽略它們,由此帶來的偏差小于0.04%,可以滿足商品化的13C-尿素的檢測要求。所以,在高豐度13C-尿素的同位素豐度計算時,按公式(1)計算既簡單又可以避免未知成分的干擾,同時也保證了結(jié)果的精準度。

(1)式中,E為13C同位素豐度;V44和V45分別為 m/z為44、45的電信號強度,單位為mV。

3 結(jié) 論

用亞硝酸氧化法轉(zhuǎn)化13C-尿素樣品為13CO2氣體時,2 mg樣品即可滿足氣體同位素質(zhì)譜的檢測要求,檢測數(shù)據(jù)的準確度、精密度都較理想。此方法有操作簡單、易于掌握、可以快速得到數(shù)據(jù)、對真空設(shè)備要求低等優(yōu)點。

高溫灼燒法制備質(zhì)譜檢測用13C-尿素樣品時,1 mg樣品即可滿足儀器檢測要求,只要嚴格控制樣品與氧化銅試劑的相對量,也能得到令人滿意的結(jié)果。與亞硝酸氧化法相比,本方法操作比較復(fù)雜,對真空設(shè)備要求較高,樣品檢測周期相對較長。但是,此方法在做批量樣品轉(zhuǎn)化和檢測13C、15N雙標(biāo)記尿素的同位素豐度時有獨特的優(yōu)勢。

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