陳增國，毛德才，毛 亮，海思源，徐亞歐

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.瀘州醫(yī)學(xué)院心肌電生理研究室，四川 瀘州 646000）

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase）簡稱SOD。1938年，Mann和Keilin首次從牛紅細(xì)胞中分離出一種含銅蛋白質(zhì)（Hemocuprein），1953年又從小牛等動(dòng)物肝中分離出肝銅蛋白。1968年，McCord和Fridovich等對Hemocuprein的功能進(jìn)行研究，由于能催化超氧陰離子O2.-的歧化反應(yīng)，因此將其命名為超氧化物歧化酶（SOD），超氧化物歧化酶的作用主要是專一地清除生物氧化中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基（Superoxide radical，O2.-）等中間物的毒性，能有效地防御活性氧對生物體的毒害作用。

按SOD中金屬輔基的不同，可將其分為以下3類：第一類是Cu/Zn-SOD，主要存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中；第二類為含有Fe、Mn或二者都有的Fe/Mn-SOD，F(xiàn)e-SOD主要存在于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的基質(zhì)中，Mn-SOD主要存在于原核細(xì)胞體、真核細(xì)胞的細(xì)胞漿和線粒體內(nèi)；第三類是NiSOD，在土壤鏈霉菌和藻青菌中發(fā)現(xiàn)。

1991年侯金泉等研究表明，不同生物的SOD含量有很大差別，就是同種生物的不同組織或同一組織的不同部位，其SOD含量也各不相同。其中SOD含量最豐富的是動(dòng)物肝臟組織，動(dòng)物血液中也富含SOD。因此，在生產(chǎn)實(shí)際中動(dòng)物Cu/Zn-SOD基本是從動(dòng)物血液的紅細(xì)胞中提取的。眾所周知，成熟的紅細(xì)胞內(nèi)沒有細(xì)胞核，那么紅細(xì)胞中的Cu/Zn-SOD是在成熟紅細(xì)胞中合成的，還是在其他細(xì)胞合成后轉(zhuǎn)運(yùn)到紅細(xì)胞中的呢？為此，本試驗(yàn)選擇牦牛血液作為研究對象，檢測牦牛血液中是否存在合成Cu/Zn-SOD的mRNA。

1 材料與方法

1.1 材料 牦牛新鮮血液取自四川省阿壩州紅原縣的純種牦牛，頸靜脈采血10mL，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要儀器及試劑：iCycler iQTM熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國）；凝膠成像系統(tǒng)Doc2000（Bio-Rad公司，美國）；Tgradient PCR 儀（Biometra公司，德國）。無水乙醇，瓊脂糖等購自Promga公司；分子量標(biāo)準(zhǔn)物 DL2000，Takara RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒，DEPC、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒，BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，pGM-T PCR產(chǎn)物克隆試劑盒均購自北京天為時(shí)代公司。

1.2 方法

1.2.1 牦牛血液總RNA提取 取牦牛新鮮血液300 μL，采用trizol法提取總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度。

1.2.2 PCR引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)奶牛Cu/Zn-SOD cDNA序列（序列號：NM 174615），用Primer 5軟件設(shè)計(jì)一對PCR引物，上游引物序列為5′-GGCGTCGTTT TCTCTACTTGGT-3′、下游引物序列為 5′-GTGCCACA GAGAATGTTTAT-3′（Ysod1、Ysod2），由四川英駿生物公司合成。擴(kuò)增片段大小為483bp。

1.2.3 cDNA第一條鏈合成和PCR擴(kuò)增 以提取的總RNA樣品為模板，Oligo-dT為引物，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一條鏈。反應(yīng)體系用Takara RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒合成cDNA第一條鏈，其配置參考Takara RNA PCR試劑盒說明書。反應(yīng)條件為45℃反應(yīng)45min，99℃反應(yīng)5min，4℃保存。

以合成的第一條cDNA鏈為模板，以Ysod1、Ysod2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR 反應(yīng)體積 50μL，包括 2μLMgCl2，5μL 10×PCR Buffer，0.25 μL ExTaq，1 μL dNTP，0.5 μL Ysod1，0.5μL Ysod2，2μL RT產(chǎn)物，38.75μL去離子水。94℃預(yù)變性2 min，然后進(jìn)入PCR循環(huán)，58.5℃退火30 s、72℃延伸1min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，4℃保存，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 RT-PCR產(chǎn)物克隆測序 按pBS-T PCR產(chǎn)物克隆試劑盒提供的方法將PCR產(chǎn)物與載體連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，逐一挑取單個(gè)白色菌落，接種于LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)后取菌液進(jìn)行PCR鑒定，所得條帶與RT-PCR擴(kuò)增條帶大小相同。挑選經(jīng)過PCR、凝膠電泳檢測為陽性的菌液交由四川省成都市英駿生物公司測序。

2 結(jié)果及分析

2.1 牦牛血液總RNA提取 對從牦牛血液中提取的總RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1。由圖1可見，從牦牛血液中提取的總RNA電泳后可見一條較淺的28S的RNA譜帶，這與本實(shí)驗(yàn)室毛德才從牦牛肝臟組織樣品中提取的總RNA存在28S、18S、5S譜帶有明顯的不同（圖2）。

2.2 牦牛Cu/Zn-SOD RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后，獲得1條大小約為483bp的特異性條帶，與預(yù)期目標(biāo)片段大小基本一致，見圖3。

圖1 牦牛血液總RNA樣品電泳圖

圖2 牦牛肝臟總RNA電泳結(jié)果

圖3 RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.3 牦牛Cu/Zn-SOD T-A克隆鑒定 將RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按少量DNA膠回收說明書進(jìn)行回收后，取5 μL回收產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)一條較純的目的片段，說明膠回收成功。膠回收產(chǎn)物與pGM-T載體連接后，轉(zhuǎn)化到宿主菌TOP10并涂在含有Amp的LB固體平板上，37℃培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑取白斑轉(zhuǎn)到含100 mM Amp的LB液體培養(yǎng)基中搖轉(zhuǎn)培養(yǎng)過夜，然后以菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)鑒定重組結(jié)果。

2.4 重組子的PCR鑒定 挑選白色菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，以菌液中的重組子為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)PCR擴(kuò)增片段位于約483bp處，與RT-PCR產(chǎn)物電泳圖一致，初步確定克隆成功（見圖4）。

2.5 克隆產(chǎn)物測序 挑選經(jīng)過PCR、凝膠電泳檢測為陽性的菌液交由四川省成都市英駿生物公司測序，結(jié)果得出測序片段大小為483bp。經(jīng)比較，與毛德才從牦牛肝臟組織中獲得的cDNA序列完全一致。

圖4 重組子PCR鑒定結(jié)果圖

3 小結(jié)與討論

通過對比牦牛血液總RNA樣品電泳圖和牦牛肝臟組織總RNA電泳圖，發(fā)現(xiàn)牦牛血液樣品總RNA樣品電泳圖可見一條較淺的28S RNA譜帶，因此證實(shí)了牦牛血液中的RNA含量很低。

本試驗(yàn)選取高原畜種牦牛為研究對象，從牦牛血液中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄克隆了牦牛Cu/Zn-SOD cDNA，經(jīng)測序，片段大小為483bp。證實(shí)該序列是牦牛SOD的cDNA序列。

由于成熟的紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞核，因此并不具備合成SOD的條件，但是本試驗(yàn)卻從牦牛血液中提取到了少量SOD的mRNA。那么，牦牛血液中合成SOD的mRNA就可能有幾個(gè)來源：第一，可能是紅細(xì)胞還沒有成熟前就已經(jīng)合成了SOD蛋白質(zhì)；第二，可能是其他細(xì)胞合成后轉(zhuǎn)運(yùn)到紅細(xì)胞中的。而紅細(xì)胞中的具體來源還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

[1]Mannt，Keilin D. Hemocuprein and hepatocuprein copper-protein compounds of blood and liverin mammals[J].Proe R SoeB，1938，126：303-315.

[2]McCord J M，F(xiàn)rodovich I.Superoxide dismutase.An enzymic function for erythrocuprein （hemocuprein）[J].Biol.Chem.，1969，244：6049-6055.

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[4]王慶莉，王居亮，陳德展.超氧化物歧化酶的理論研究進(jìn)展[J].山東師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，24（2）.

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