陳貞干, 唐小梅, 陳遠(yuǎn)道, 周詩彪

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木芙蓉提取物中蕓香苷含量的高效液相色譜法測定

陳貞干, 唐小梅, 陳遠(yuǎn)道, 周詩彪

(湖南文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院, 湖南 常德, 415000)

建立木芙蓉提取物中蕓香苷含量的HPLC定量測定法. 以蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品為對照進(jìn)行反相高效液相色譜法測定：測定的色譜柱為nova-park C18(3.9×150 mm, 4 μm), 流動相為甲醇-1%醋酸溶液(50/50,/), 流速為1 mL/min, 用紫外檢測器檢測, 檢測波長為254 nm. 蕓香苷與木芙蓉中其他成分基線分離良好, 蕓香苷在4.16~41.6 mg/L范圍內(nèi), 峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系(= 0.9993). 確定了精密度日內(nèi)RSD在5.32%～6.02%.

高效液相色譜; 蕓香苷; 木芙蓉

蕓香苷又名蘆丁、紫槲皮苷, 為黃色結(jié)晶粉末或無晶形粉末, 有苦味, 略溶于冷水, 能溶于熱水、乙醇、甲醇[1-2]. 蕓香苷可以直接作為藥品, 也用于復(fù)配和藥物的中間體. 目前, 我國蕓香苷生產(chǎn)主要以槐米(槐花的花蕾)為原料進(jìn)行提取[3]. 槐米因資源不足, 不能充分滿足市場需求呈現(xiàn)出原料供應(yīng)緊張現(xiàn)狀. 本文試圖從木芙蓉葉中提取蕓香苷并采用高效液相色譜法測定其含量.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

高效液相色譜儀(waters 1525 美國waters 公司生產(chǎn)), 配套的紫外檢測器(waters 2487美國waters公司生產(chǎn)), 手動進(jìn)樣器(25μL), 十八烷基色譜柱(3.9×150mm, 4μm), 電子天平(BS201, 精確度1×10-5g, 德國賽多利斯公司生產(chǎn)), 超聲波清洗儀(BS3200, 上海必能信公司), 恒溫水浴鍋、索氏提取器等.

1.1.2 試劑、原料

甲醇(AR、色譜純)、冰醋酸(AR)、蕓香苷對照品(中國藥品生物制品檢定所)、二次蒸餾水(自己制備)、木芙蓉葉(湖南文理學(xué)院內(nèi)采摘).

1.2 蕓香苷的提取

用電子天平精確稱取木芙蓉葉約3g(精確到具體數(shù)值), 置于100 mL圓底燒瓶中, 再用量筒量取40 mL、60%的甲醇溶劑加入到圓底燒瓶中, 70 oC水浴回流2.5 h左右, 趁熱抽濾, 殘?jiān)眉状枷礈?～3次洗滌液并入濾液, 濾液再用定量濾紙過濾, 濾液用甲醇定容于100 mL容量瓶中, 再用移液管從中移取10 mL于25 mL容量瓶中用甲醇定容.

1.3 蕓香苷含量的測定

1.3.1 蕓香苷測定的色譜條件

用蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液確定最佳的色譜條件：色譜柱為十八烷基柱, 流動相為甲醇-1%醋酸溶液(50/50,/), 流速為1.0 mL/min, 檢測波長為254 nm進(jìn)樣量為10 μL, 室溫條件下操作. 待儀器穩(wěn)定后, 取樣品液10 μL進(jìn)樣, 外標(biāo)法定量, 測定樣品中蕓香苷的含量.

外標(biāo)法峰面積定量, 在上述色譜條件下, 對照品與樣品色譜圖如下:

圖1 蕓香苷對照品

圖2 木芙蓉葉提取物樣品

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

用電子天平精確稱取蕓香苷的標(biāo)準(zhǔn)樣品0.0260 g, 用甲醇定容到250 mL, 然后用移液管分別移取1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL置于不同的25 ml容量瓶中, 甲醇稀釋定容至刻度, 搖勻. 以峰面積對濃度(mg/L)作圖, 得到相關(guān)線性方程.

表1 A(峰面積)—C(對照品濃度)關(guān)系試驗(yàn)

線性方程: A=15 086C-26 310; R=0.999 3; 線形范圍: 4.16~41.6 mg/L

2 結(jié)果與問題討論

2.1 蕓香苷提取條件

2.1.1 索氏提取法的影響因素

現(xiàn)代色譜分析樣品制備技術(shù)的發(fā)展趨勢就是使處理樣品過程要簡單, 處理速度要快, 使用裝置要小, 對欲測定組分的選擇性和回收率要高.

本文采用簡單的液—固多次萃取的方法(即索氏提取法)處理樣品, 液-固萃取包括兩個(gè)過程: 固體樣品中某些欲測組分分子在溶劑中溶解過程和欲測組分分子與溶劑分子相互擴(kuò)散的過程. 這兩個(gè)過程實(shí)際上是同時(shí)進(jìn)行的. 萃取時(shí)的擴(kuò)散主要由分子擴(kuò)散和對流擴(kuò)散組成. 在固體樣品表面與溶劑接觸處為分子擴(kuò)散, 而遠(yuǎn)離固體樣品表面處為對流擴(kuò)散, 在對流擴(kuò)散中也有分子擴(kuò)散. 對這兩種擴(kuò)散的綜合分析表明, 影響液—固萃取的因素有萃取時(shí)的溫度、溶劑的性質(zhì)與用量以及萃取時(shí)間.

經(jīng)過試驗(yàn)得到最優(yōu)提取條件為60%甲醇水溶液作溶劑, 料劑比為1:15, 萃取溫度為65～70 ℃,萃取時(shí)間為2.5 h, 收率為0.2%.

2.1.2 超聲波提取的影響因素

超聲波提取主要是利用超聲的空化作用對細(xì)胞膜的破壞, 有助于有效成分的溶出與釋放; 超聲波使提取液不斷震蕩, 有助于溶質(zhì)擴(kuò)散; 同時(shí)超聲波的熱效應(yīng)對原料有水浴作用. 影響超聲提取的因素有超聲波的頻率和提取時(shí)間. 經(jīng)試驗(yàn)得出采用超聲波法提取木芙蓉葉中蕓香苷的較佳工藝條件為: 原材料浸泡時(shí)間2.5 h, 超聲波頻率0.02 MHz, 超聲空化震蕩提取時(shí)間0.5 h, 收率為0.14%.

2.2 蕓香苷高效液相色譜測定法

2.2.1 色譜條件的確定

蕓香苷屬于黃酮類化合物, 為極性化合物, 略溶于水易溶于極性溶劑甲醇, 可以選用反向色譜柱來分離測定. 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道C18柱對黃酮類化合物能夠有效的分離[4-6], 因此本實(shí)驗(yàn)選用C18柱. 將蕓香苷的甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液在紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行掃描, 可得知蕓香苷在190～600 nm范圍內(nèi)有2個(gè)特征吸收峰202、254 nm, 在202 nm處蕓香苷吸收較254 nm處大, 但流動相1%醋酸溶液、甲醇的測定截止波長均在200 nm附近, 故本實(shí)驗(yàn)選擇254 nm作為檢測波長. 在反相色譜中, 常用的流動相是甲醇(MeOH)、乙腈(CH3CN)和四氫呋喃(THF)等有機(jī)溶劑與水的混合物, 有機(jī)相是強(qiáng)溶劑, 水是弱溶劑, 改變有機(jī)相和水的比例, 可調(diào)整流動相的強(qiáng)度. 本實(shí)驗(yàn)中樣品為木芙蓉的提取物成分復(fù)雜，如果僅用甲醇—水或乙腈—水二元溶劑無法將蕓香苷與其他成分分離開. 考慮到蕓香苷分子中酚羥基易產(chǎn)生電離, 在固定相表面有雙重保留機(jī)制的緣故而使峰有嚴(yán)重的拖尾[7], 在流動相中加入1%的醋酸可使酚的電離得到抑制, 成為在反相條件下疏水締合物型的中性分子, 分離效果和峰形都可得到較大的改善. 本實(shí)驗(yàn)當(dāng)選擇甲醇—1%醋酸溶液(/)為50: 50, 流動相流速1 mL/min時(shí)蕓香苷出峰時(shí)間短, 與其他成分的分離效果良好.

2.2.2 精密度試驗(yàn)

取蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液高、中、低三個(gè)濃度(8.32 mg/L, 24.96mg/L, 41.6mg/L), 分別在日內(nèi)不同時(shí)間(0, 1, 3, 6h)進(jìn)行HPLC測定, 分析結(jié)果如表8.從表8所顯示的數(shù)據(jù), 可以知道樣品的測定在日內(nèi)有較好的精密度.

表2 精密度試驗(yàn)數(shù)據(jù)及處理結(jié)果

2.2.3 回收率試驗(yàn)

表3 第1次回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)果處理

表4 第2次回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)果處理

表5 第3次回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)果處理

3 結(jié)論

從木芙蓉葉中可提取蕓香苷, 索氏提取法的提取率高于超聲波提取法, 含量在0.2%左右. 索氏提取法的最佳條件：60%甲醇水溶液作溶劑, 料劑比為1: 15, 萃取溫度為65～70 ℃, 萃取時(shí)間為2.5 h. 采用高效液相色譜外標(biāo)法可測定木芙蓉葉中蕓香苷含量. 分離測定樣品采用十八烷基柱(3.9×150 mm, 4 μm), 流動相為甲醇—1%醋酸(50/50,/), 流速為1mL/min, 紫外檢測器的檢測波長為254 nm. 蕓香苷在4.16～41.6 mg/L范圍內(nèi)線性良好(= 0.999 3). 日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在5.32%～6.02%范圍內(nèi), 高、中、低濃度回收率平均值為98%.

[1] 姚莉韻, 陸陽, 陳譯乃. 木芙蓉葉化學(xué)成分研究[J]. 中草藥, 2003, 34(3)：201-203.

[2] 程秀民, 張建禮, 王厚金, 等. 精致蘆丁及其同系物的HPLC測定[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2003, 34(10): 525- 526.

[3] 李培凡, 張韻慧, 肖莉, 等. RP—HPLC法測定不同產(chǎn)地槐米中蘆丁[J]. 中草藥, 2006, 37(9): 1419-1420.

[4] Kazuo Ishii, Takashi Furuta, Yasuji kasuya. Determinat- ion of rutin in human plasma by HPLC.utilizing solidph- ase extraction and ultraviolet[J]. J Chormatogr B, 2001, 759: 161.

[5] 方傳代, 鄒盛勤. 反相高效液相色譜法測定金銀花中黃酮類成分的含量[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006, 34(11): 2321-2322.

[6] 楊亞玲, 周強(qiáng), 劉東輝，等. 固相萃取和高效液相色譜法測定魚腥草中的黃酮[J]. 云南大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 28(2): 157-160.

[7] 何旭元, 胡霞, 陳遠(yuǎn)道.烷基硫醚氣相色譜保留指數(shù)預(yù)測[J]. 湖南文理學(xué)院學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2009, 21(4):35-39.

Content determination of Rutin in hibiscus mutabilis by HPLC

CHEN Zhen-gan, TANG-Xiao-mei, CHEN Yuan-dao, ZHOU Shi-biao

(College of Chemistry & Chemical Engineering, Hunan University of Arts and Science, Changde 415000, China)

To establish a method for content determinate of Rutin in Hibiscus mutabilis by HPLC. The chromatograp- hic column was C18 column(3.9×150 mm, 4 um), methanol and 1% acetic acid solution (50/50,/) as mobile phase, at a flow rate of 1.0 mL/min, detection wavelength 254nm.Good linearity was obtained for Rutin and other components in the range of 4.16 ~ 41.6 mg/L peak area was favorable linear between the concentration of Rutin in range. The regression equation was=15 086*C-26 310, correlation coefficient= 0.999 3, The RSD of intra-day assay is within 5.32% ~ 6.02%.

HPLC; hibiscus mutabilis; rutin

O 657.7+2

A

1672-6146(2010)03-0053-04

10.3969/j.issn.1672-6146.2010.03.014

2010-07-20

湖南省教育科學(xué)“十一五”規(guī)劃課題(XJK08BJG006)

陳貞干 (1957-), 男, 高級實(shí)驗(yàn)師, 主要研究方向?yàn)橛袡C(jī)分析.