余 斌,劉 娟,劉 昕,黃慧英,王 清

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅蘭州 730070;3.甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室,甘肅蘭州 730070)

甘草(Glycyrrhiza uralensis)為豆科甘草屬多年生草本植物,根和根莖具有極高的藥用價值[1],素有“國老”、“十方九草”之譽[2]。同時,甘草在食品、飲料、卷煙、化妝品等行業(yè)中都有廣泛的應(yīng)用[3]。近10年,人們破壞性地采挖野生甘草,使野生甘草種群面積迅速減小,種群質(zhì)量不斷下降,甘草資源面臨嚴(yán)重危機(jī)[4,5]。為了保護(hù)甘草這一寶貴的種質(zhì)資源,同時滿足國內(nèi)外市場對甘草日趨劇增的需求,迫切需要開展大面積人工栽培甘草。但由于野生甘草種子發(fā)芽率極低(5%～10%),而甘草的組織培養(yǎng)可以很好的解決這一問題。組織培養(yǎng)技術(shù)中試管苗培養(yǎng)體系對培養(yǎng)物的生長狀態(tài),增殖及分化方向有著較大的影響,是組織培養(yǎng)技術(shù)中的關(guān)鍵因素[6]。所以進(jìn)行甘草試管苗培養(yǎng)體系的優(yōu)化對,開展組織培養(yǎng)快速繁殖甘草苗就具有十分重要的意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

甘肅省廣泛種植的烏拉爾甘草,由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院作物遺傳育種教研室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料的擴(kuò)繁培養(yǎng) 挑選籽粒飽滿的甘草種子,用70%的酒精浸泡2～3 min,然后15%的84消毒液浸泡15～20 min,再用無菌水漂洗3～4次。將消毒后的種子接種在經(jīng)高壓滅菌的MS固體培養(yǎng)基中(pH 5.8),每個三角瓶接15～20粒種子,待種子萌發(fā)并形成4～5片真葉的幼苗時作為試驗的備用材料。

1.2.2 不同培養(yǎng)方式及不同外源激素下甘草試管苗的形成 將甘草幼苗剪切成兩葉莖段,接種在固體、液體和固液雙層培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每種培養(yǎng)方式均設(shè)置5種培養(yǎng)基配方,分別為:

①MS+1.0 mg/L IBA+13.5 mg/L KH2PO4

②MS+13.5 mg/L KH2PO4

③MS+1.0 mg/L IAA+13.5 mg/L KH2PO4

④MS+1.0 mg/L IAA+1.5 mg/L 6-BA

⑤MS+1.0 mg/LIAA+13.5 mg/L KH2PO4+1.5 mg/L 6-BA

按照文獻(xiàn)[7]固體、液體、固液雙層培養(yǎng)方法,于每一種培養(yǎng)基配方下接種6瓶甘草試管苗,每瓶接入5個莖段。將試管苗置于25℃,2 000 lx光照條件下培養(yǎng),40 d后測量植株全長、株高、根長、根直徑以及稱量試管苗的鮮重。采用精度為0.01 mm的游標(biāo)卡尺測量根中部直徑為根直徑。其余指標(biāo)按照常規(guī)方法測量或稱量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外源激素水平對甘草試管苗生長的影響

2.1.1 不同外源激素水平對固體培養(yǎng)基中甘草試管苗生長的影響 對固態(tài)培養(yǎng)基下甘草試管苗不同性狀的方差分析表明,供試指標(biāo)全長、株重、根直徑、根長和根重均在①、②、③號培養(yǎng)基中表現(xiàn)較高。與④和⑤中各項生長指標(biāo)相比,均達(dá)到極顯著差異(表1)。說明①、②和③號培養(yǎng)基是甘草試管苗的適宜培養(yǎng)基。從葉片數(shù)看,①號培養(yǎng)基的甘草試管苗平均葉片數(shù)為8.88片/株,極顯著的高于其他培養(yǎng)基上的葉片數(shù)。說明①號培養(yǎng)基最適合于甘草試管苗的生長。

2.1.2 不同外源激素水平對液體培養(yǎng)基下甘草試管苗生長的影響 通過對液態(tài)培養(yǎng)方式下試管苗的各項生理指標(biāo)的方差分析,可得出以下結(jié)論,無論是葉片數(shù)、株重、根直徑還是根長和根重,①、②、③培養(yǎng)基中表現(xiàn)較好,與④和⑤各項生長指標(biāo)相比,均達(dá)到極顯著差異(表2)。但就全長來說還是以①的值最高,且顯著的高于其他激素配比。因此,在液態(tài)培養(yǎng)方式下,生長狀態(tài)最好的激素配比仍然是①,在今后的研究中可作參照。

2.1.3 不同外源激素水平對固液雙層培養(yǎng)基下甘草試管苗生長的影響 對固液雙層培養(yǎng)方式下甘草試管苗不同性狀的方差分析表明,試管苗的葉片數(shù)、根直徑、根長和根重在①、②、③培養(yǎng)基中無顯著差異。全長和株重在①和②培養(yǎng)基中表現(xiàn)更好。在①培養(yǎng)基中全長和株重的值分別為12.06 cm和0.15 g,在②中的值分別為12.08 cm和0.14 g。而各項生理指標(biāo)與④和⑤相比,均達(dá)到極顯著差異(表3)。由此說明,13.5 mg/L KH2PO4和在此基礎(chǔ)上加有1.0 mg/L IBA的培養(yǎng)基更有利于甘草試管苗的生長及生根。

表1 不同外源激素水平在固態(tài)培養(yǎng)方式下對甘草試管苗各性狀的影響Table Representations of licorice seedlings cultured in vitro with solid mediums

表2 不同外源激素水平在液態(tài)培養(yǎng)方式下對甘草試管苗各性狀的影響Table 2 Representations of licorice seedlings cultured in vitro with liquid mediums

表3 不同外源激素水平在固液雙層培養(yǎng)方式下對甘草試管苗各性狀的影響Table 3 Representations of licorice seedlings cultured in vitro with combinations of liquid mediums and solid mediums

2.2 不同培養(yǎng)方式對甘草試管苗生長的影響

分別將3種培養(yǎng)方式下,在各個外源激素水平中獲得的各項生理指標(biāo)的平均值進(jìn)行對比,分析不同培養(yǎng)方式對甘草試管苗生長的影響。

無論是全長還是根長均以固體培養(yǎng)基下生長的甘草試管苗最好(圖1)。在固體培養(yǎng)基中試管苗全長和根長的平均值分別為10.03 cm和2.65 cm,比液體培養(yǎng)基下的相應(yīng)指標(biāo)分別高19.42%和92.97%;比固液雙層下的高28.90%和48.88%。

另外,試管苗根的直徑在固態(tài)培養(yǎng)方式下明顯大于液態(tài)和固液雙層培養(yǎng)下的甘草根直徑(圖2),其平均直徑0.88 mm,比液體培養(yǎng)基中的值高90.59%,比固液雙層中的值高13.86%。

圖1 不同培養(yǎng)方式對甘草試管苗的全長及根長的影響Fig.1 The length of seedling and root of licorice cultivated in vitro with different culture manners

圖2 不同培養(yǎng)方式對甘草試管苗的根直徑的影響Fig.2 Root diameter of licorice seedling cultivated in vitro with different culture manners

根重和株重也以固態(tài)培養(yǎng)基下生長的甘草試管苗最好,其根重和株重的平均值為0.040 g和0.138 g,比液態(tài)培養(yǎng)基下的相應(yīng)指標(biāo)高71.7%和53.3%。另外,株重平均值比固液雙層培養(yǎng)基下的相應(yīng)指標(biāo)高38.0%,但是,根重在固體及固液雙層培養(yǎng)基中無差異(圖 3)。

此外,甘草試管苗葉片數(shù)也以固體培養(yǎng)基中的最多,為5.93(片)。分別比液態(tài)培養(yǎng)基的多25.4%,比固液雙層培養(yǎng)基的多高18.2%(圖4)。

圖3 不同培養(yǎng)方式對甘草試管苗的根重和株重的影響Fig.3 Fresh root weight and seedling weight of licorice cultivated in vitro with different culture manners

圖4 不同培養(yǎng)方式對甘草試管苗的葉片數(shù)的影響Fig.4 The number of leaves of licorice seedling cultivated invitrowith different culture manners

3 討論

通過比較3種不同培養(yǎng)方式下甘草試管苗的生長狀態(tài)在固態(tài)培養(yǎng)方式下生根及生長狀態(tài)最好,加之固體培養(yǎng)方式穩(wěn)定性好,操作簡便,應(yīng)為甘草試管苗的最適培養(yǎng)方式,這也證實了Bteat T等[8,9]提出的固體培養(yǎng)方式在生產(chǎn)中是目前使用的甘草組織培養(yǎng)中最常用的培養(yǎng)方式。固液雙層培養(yǎng)雖在根重方面與固態(tài)培養(yǎng)間無明顯差別,但其操作繁瑣,藥品浪費較大,而且其余生理指標(biāo)均不如固態(tài)培養(yǎng)方式,所以培養(yǎng)效果應(yīng)次于固體培養(yǎng)方式。液體培養(yǎng)在3種不同培養(yǎng)方式中甘草試管苗生長狀態(tài)最差,而且,其要求操作精細(xì),如在操作過程中一個材料出現(xiàn)污染,將導(dǎo)致全瓶材料的共同污染,從而在以后的甘草試管苗培養(yǎng)方式中不適宜用液體培養(yǎng)。

試驗得到了最適合于甘草試管苗生長的培養(yǎng)基配方(MS+1.0 mg/L IBA+13.5 mg/L KH2PO4)。還發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基中凡加入了KH2PO4的甘草試管苗各指標(biāo)性狀均表現(xiàn)較好。可能因為P是核酸、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜的組成成分,并且在生物體新陳代謝中起著重要的作用。K對參與活體內(nèi)各種反應(yīng)的酶起著活化劑的作用,且能促進(jìn)呼吸進(jìn)程及核酸和蛋白質(zhì)的形成[10]。KH2PO4在甘草培養(yǎng)基中增加P和K的含量,可使甘草莖段生根速度快而健壯,而且生根率、種苗移栽成活率均有提高。

試驗中,培養(yǎng)基④、⑤中加入了6-BA的甘草試管苗生長狀態(tài)均不佳,不僅沒有形成根,而且在基部產(chǎn)生愈傷組織,并在后期出現(xiàn)褐化,這是由于甘草試管苗難以利用外源6-BA及其代謝中間物,對植株各項生理參數(shù)表現(xiàn)出惡化趨勢,謝紹萍[11]在研究甜菊愈傷組織生長分化發(fā)現(xiàn),適當(dāng)濃度的6-BA能有效地誘導(dǎo)芽的發(fā)生,但高濃度則抑制芽的發(fā)生。但外源6-BA是如何負(fù)面影響植物生長,目前,文獻(xiàn)存在不同的觀點,其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

[1] 杜茜.水分和肥料對甘草產(chǎn)量及品質(zhì)的影響[J].草原與草坪,2007(5):62-64.

[2] 張繼,姚健,丁蘭,等.甘草的利用研究進(jìn)展[J].草原與草坪,2000(2):12-17.

[3] 王照蘭,杜建材,于林清,等.甘草的利用價值、研究現(xiàn)狀與存在的問題[J].中國草地,2002,24(1):73-76.

[4] 楊之暢.內(nèi)蒙古伊克昭盟甘草、麻黃資源的保護(hù)和利用問題[J].自然資源,1989(1):70-73.

[5] 楊戈,李銀芳.麥蓋提縣的甘草資源及其保護(hù)和利用干早區(qū)研究[J].1994,11(3):35-38.

[6] 馮慧敏.遺傳工程在牧草育種方面的研究現(xiàn)狀及展望[J].草原與草坪,1994(2):8-9.

[7] 彭曉莉,王蒂,張金文,等.激素誘導(dǎo)下不同培養(yǎng)方式對馬鈴薯微型薯的誘導(dǎo)效應(yīng)[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2006,41(1):16-19.

[8] Bteat T,Carle V.Development of an automated plant culture system[J].Plant Cell Tissus and Organ Culture,1985,5(2):107.

[9] Ecluardo H,Kitahhara,Linda S,et al.Shoot and root formation in cells cultures of Eucalyptus[J].Forest Sci,1975,(121):242-243.

[10] 于林清,何茂泰,王照蘭等.甘草組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)研究[J].中國草地,1999(1):12-14.

[11] 謝紹萍,歐陽學(xué)智,洪維廉,等.甜菊愈傷組織生長、分化與甜菊苷積累的關(guān)系[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報,1998,6(1):4-8.