耿士忠，潘志明，劉 杰，劉志成，方 強(qiáng)，焦新安

（揚(yáng)州大學(xué)江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009）

沙門氏菌是常見的人和動物的重要病原菌之一，呈全球性分布。多種沙門氏菌均可感染豬，主要包括：海德堡沙門氏菌（Salmonlla heidelberg）、華盛頓沙門菌（Salmonlla worthington）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonlla typhimurium）、鼠傷寒沙門氏菌哥本哈根變種（S.typhimurium-var.copenhagen）、新生兒德爾卑沙門氏菌（Salmonlla derby）、 嬰 兒 沙 門 氏 菌（Salmonlla infantis），以及乙型副傷寒沙門氏菌（Salmonlla paratyphi B）、斯坦利沙門氏菌（Salmonlla stanley）、雷根特沙門氏菌（Salmonella regent）、豬霍亂沙門氏 菌（Salmonlla choleraesuis）、 腸 炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）等血清型。其中豬霍亂沙門氏菌和德爾卑沙門氏菌對豬具有宿主適應(yīng)性，感染母豬可長時間攜帶病原。世界上最大的一起由沙門氏菌引起的食物中毒，1953年發(fā)生在瑞典，是由食用豬肉而引起的鼠傷寒沙門氏菌中毒，導(dǎo)致7 717人中毒，90人死亡。由于沙門氏菌菌型、菌株不同，致人發(fā)病的菌量也不同，一般使人發(fā)病的菌量平均為107cfu以上。鼠傷寒沙門氏菌是最常見的血清型，在國外占27.7%～80%，其次為腸炎沙門氏菌占10.3%。某省10年來的統(tǒng)計資料顯示豬在屠宰前感染沙門氏菌是比較嚴(yán)重的，其檢出率高達(dá)26.5%。由于帶菌率高，在屠宰加工過程中，往往可造成豬肉污染，豬肉的沙門氏菌檢出率為12.5%。肉類食品從宰殺到烹調(diào)加工的各個環(huán)節(jié)中，都可受到污染。烹調(diào)后的熟肉，如果再次受到污染，并且在較高的溫度下保存，食用前又不再加熱，則更為危險。有些細(xì)菌主要在生長豬以及一些母豬的腸道內(nèi)繁殖。感染豬可連續(xù)數(shù)周甚至數(shù)月從糞便中排出病原，而不表現(xiàn)任何癥狀。在屠宰的時候，豬腸道中的沙門氏菌可能污染胴體，導(dǎo)致人類食物中毒，對公共健康構(gòu)成潛在威脅。有些細(xì)菌如豬霍亂和豬傷寒沙門氏菌，可引起仔豬發(fā)病，是仔豬的一種較常見的腸道傳染病，而在成年豬中很少發(fā)生。該病在各地豬場均有發(fā)生，特別是在衛(wèi)生條件差的豬場常有發(fā)生，給養(yǎng)殖業(yè)造成很大損失。此病主要危害1～4月齡斷奶仔豬，所以是規(guī)?；i場提高仔豬成活率與經(jīng)濟(jì)效益的大敵[1]。由于這些沙門氏菌是多種豬肉產(chǎn)品的污染源，因而豬的沙門氏菌病備受關(guān)注，全世界所有國家都非常重視沙門氏菌控制。

沙門氏菌主要寄生于人和動物的腸道中，但由于其在環(huán)境中具有較強(qiáng)的生存能力，所以在環(huán)境中也廣泛存在，常見于農(nóng)場的污水、人類生產(chǎn)的污物以及被糞便污染的物體中。該細(xì)菌通常由亞臨床感染動物的排泄物通過施肥或澆灌等方式造成環(huán)境源性污染，造成水果蔬菜等二次污染，引起人間接感染，或者引起食源性污染，如肉、蛋、奶等直接污染，引起人因食用污染食物而感染，并致人腹瀉或系統(tǒng)性疾病。豬沙門氏菌病引起的嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，對豬肉的食品安全及國際貿(mào)易形成較大威脅。因此對豬沙門氏菌的檢測及診斷就顯得至關(guān)重要。

自19世紀(jì)后期，沙門氏菌首次被鑒定為人類的一種病原以來，檢測方法學(xué)都是建立在采集感染動物或患病者的糞便或血液作為臨床病料的基礎(chǔ)上。此后的60年間，用于從食品中分離沙門氏菌的方法實(shí)質(zhì)上與那些用于臨床病料的方法是相同的。但至少有3個因素限制了用于臨床病料的方法應(yīng)用在食品分析上。第一，通常，沙門氏菌的含量水平在污染食品中比在感染病人的病料中要低很多；第二，食品本身的性質(zhì)會干擾病原的檢測，例如，某些食品中固有菌群可能處在一個很高的水平，從而影響特定細(xì)菌的選擇性分離和鑒定；第三，與臨床病料不同的是，經(jīng)過加工的食品，由于加熱、干燥、高含鹽量、酸和冷凍等因素的作用，其中的沙門氏菌受到了尚不致命的損傷或稱“致傷”，這就形成了一個具有不同生長特性的細(xì)菌群，這種現(xiàn)象對那些希望從食物樣品中分離出沙門氏菌的食品分析家來說有很大影響，因?yàn)樵谶x擇培養(yǎng)基上直接培養(yǎng)“致傷”的沙門氏菌通常是以細(xì)菌死亡和試驗(yàn)失敗而告終。為克服這些困難，人們建立了一種簡單的微生物增殖步驟，專門針對以食品為傳播載體的病原。雖然這些方法本身證明是可靠的，但卻很費(fèi)力、耗時，需要3～6 d才能完成。因此，在需要及時、快速評價食品中微生物的安全性時，通常不被采用。隨著DNA和單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展，近幾十年間發(fā)展了許多改進(jìn)的方法，其中一些方法可以在12～24 h內(nèi)檢出沙門氏菌，這些方法通稱為快速檢測。

圖1 脈沖場凝膠電泳(PFGE)儀

圖2 實(shí)時定量PCR儀

圖3 磁分選儀

1 直接法——傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法

用于檢測沙門氏菌的傳統(tǒng)方法是將食物樣品分步增菌，以提高病原菌的檢出率。這種培養(yǎng)方法總體可分為3個不同階段，預(yù)增菌、選擇性增菌及分離步驟。傳統(tǒng)沙門氏菌檢測法全過程需時至少4～7 d，才能得出明確的診斷結(jié)果。GB 4789.4-94是目前我國規(guī)定的對畜產(chǎn)品中沙門氏菌的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，主要是根據(jù)沙門氏菌的生化特性，進(jìn)行預(yù)增菌、選擇性增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定和血清分型5個步驟。在檢測畜產(chǎn)品過程中，應(yīng)注意根據(jù)不同的樣品采取不同的檢測步驟。第1步預(yù)增菌，不表現(xiàn)臨床癥狀的動物糞便、環(huán)境樣品、動物飼料和食物中的沙門氏菌數(shù)量通常很低，必須使用預(yù)增菌培養(yǎng)基（如緩沖蛋白胨水），它能使少量的沙門氏菌增殖，以利于細(xì)菌分離，或使用普通預(yù)增菌液以幫助細(xì)菌分離。將樣品添加到一種高營養(yǎng)、無選擇性的培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，有助于因被冷凍、加熱、干燥或生物試劑等因素而致于瀕死的沙門氏菌復(fù)蘇。預(yù)增菌對較少的生長較活潑的沙門氏菌可能不是最好的方法，如來自糞便的熱適應(yīng)菌株，因?yàn)樵诜沁x擇性預(yù)增菌過程中，競爭性細(xì)菌生長過快而難以分離。第2步是選擇性增菌步驟，它能選擇性地使沙門氏菌生長，而抑制其他細(xì)菌的生長，有時也對某些血清型的沙門氏菌有抑制和致死作用，如亞硒酸能抑制和致死豬霍亂沙門氏菌，亮綠對都柏林沙門氏菌有害。除了在培養(yǎng)基中添加特定成分外，還常常用提高溫度的方法來增加增菌培養(yǎng)基的選擇性，不少實(shí)驗(yàn)室采用的溫度為43 ℃。目前應(yīng)用的培養(yǎng)基主要有如下幾種類型：含四磺酸鈉的Muller-Kauffman肉湯、亞硒酸鹽F-亞硒酸鹽半胱氨酸-亮綠磺、Rappaport-Vassiliadis培養(yǎng)基或半固體Rappaport-Vassiliadis培養(yǎng)基、連四硫基鹽肉湯（Tetrathionate broth）、硒酸鹽胱氨酸肉湯（Selenitecystinebroth），現(xiàn)在Rappaport-Vassiliadis培養(yǎng)基的推薦溫度為41.5 ℃。活力選擇增菌培養(yǎng)基用來增加沙門氏菌的敏感性，半固體培養(yǎng)基，如MSRV或DIASALM（診斷用半固體培養(yǎng)基）可以提供更好的選擇性。由于沒有任何一種培養(yǎng)基可以全面地保持所有食品基質(zhì)或各種沙門氏菌血清型，所以，較適當(dāng)?shù)淖龇ň褪鞘褂?種培養(yǎng)基平行地進(jìn)行試驗(yàn)。從某種程度上講，使用多種選擇性培養(yǎng)基或通過預(yù)增菌培養(yǎng)后，直接選擇性增菌、直接涂板會更有利。第3步選擇性平板培養(yǎng)，作為選擇性固體培養(yǎng)基，能進(jìn)行不同程度的鑒別培養(yǎng)，能抑制其他細(xì)菌生長，并能提供沙門氏菌的一些主要生化鑒別特征：無乳糖發(fā)酵和硫化氫產(chǎn)生，37 ℃培養(yǎng)24～48 h后判定結(jié)果。在這種培養(yǎng)基上，沙門氏菌形成特征性菌落，據(jù)此通常可與其他細(xì)菌菌落相區(qū)別。現(xiàn)在有一種較寬范圍的顯色培養(yǎng)基可以方便使用。有許多這樣的培養(yǎng)基有助于分離可疑菌落，但是必須確認(rèn)樣品的基體、培養(yǎng)系統(tǒng)和血清型，因?yàn)樵谀承┉h(huán)境下，細(xì)菌的感受性是很差的。第4步是分離鑒定步驟，即選擇性培養(yǎng)物在含一種或多種抑制非沙門氏菌生長制劑的瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，然后對平板上肉眼可見的特征性可疑菌落進(jìn)行確認(rèn)，并將可疑菌落在選擇和非選擇性瓊脂上作繼代培養(yǎng)，對該菌落分離物進(jìn)行一系列生化和血清學(xué)檢測，以作出鑒定。鑒定O、H抗原和在特定的情況下鑒定Vi抗原，可用特異抗血清進(jìn)行直接平板凝集試驗(yàn)。在具有雙相菌的情況下，應(yīng)通過含已知相抗血清的半固體培養(yǎng)基傳代，用相轉(zhuǎn)化法鑒定2個相，盡可能使用抗多種因子的抗血清加速篩選，因?yàn)閱我蜃友迥芨M(jìn)一步純化細(xì)菌。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室能鑒定較為普通的血清型，而進(jìn)一步鑒定某菌株應(yīng)參考實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備。傳統(tǒng)沙門氏菌檢測法全過程需時至少4～7 d，才能得出明確的診斷結(jié)果。

噬菌體對細(xì)菌有特殊的裂解作用。Thal-Kalings對 1181 株 沙 門 氏 菌 和323株其他菌株進(jìn)行沙門氏菌噬菌體O-I裂解試驗(yàn)，結(jié)果表明沙門氏菌裂解率為99.5%，而非沙門氏菌裂解率為0.3%。截至到1973年，Keils及Seeliger等人通過大量觀察證實(shí)，沙門氏菌屬內(nèi)裂解率在95.0%～99.6%之間，屬外誤差為0%～2.33%之間。何曉青等發(fā)現(xiàn)一種腸桿菌科分屬診斷噬菌體，其鑒定沙門氏菌只要6 min，加上培養(yǎng)菌落時間只需2 d。張碧波等應(yīng)用噬菌體快速檢測沙門氏菌，對100個腸桿菌菌株進(jìn)行噬菌體O-I裂解試驗(yàn)，30株沙門氏菌全部為陽性，而其余非沙門氏菌株全部為陰性，與前人研究結(jié)果一致。由此可見，應(yīng)用沙門氏菌噬菌體O-I對沙門氏菌進(jìn)行檢測方便可靠。

2 間接法

2.1 以抗體為基礎(chǔ)的檢測方法

利用抗原—抗體反應(yīng)的顯著特異性，來進(jìn)行細(xì)菌的鑒別和血清學(xué)定型，已有半個多世紀(jì)的歷史。細(xì)菌菌體或鞭毛抗原的特異性抗體的存在，使得人們可以建立一些快速方法來檢測以食品為載體的病原。已經(jīng)建立的沙門氏菌免疫學(xué)檢測方法有許多種，大致可分為以酶標(biāo)抗體（ELISA）、熒光抗體染色（免疫熒光法）、同位素標(biāo)記抗體（放射免疫試驗(yàn)）為基礎(chǔ)的方法及其他多種以抗體為基礎(chǔ)，利用乳膠凝集、免疫傳感器、免疫擴(kuò)散及免疫色譜技術(shù)的方法。但最廣泛采用的是以雙位點(diǎn)ELISA技術(shù)即夾心ELISA為基礎(chǔ)的方法。此法改進(jìn)后用化學(xué)發(fā)光替代標(biāo)記抗體，概括地說，是以固定在固體基質(zhì)上的“捕捉”抗體來捕捉目標(biāo)抗原，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的成分，加入第2種酶標(biāo)抗體，此者結(jié)合在捕捉到的抗原的不同位點(diǎn)上，第2次洗滌后加入酶作用基質(zhì)，并令其與顏色成分反應(yīng)，然后用分光光度法即很容易檢測到目標(biāo)抗原。采用微量滴定板作為固態(tài)基質(zhì)使反應(yīng)形式標(biāo)準(zhǔn)化，并促成其自動化。

HerdChek Swine Salmonella Antib ody Test Kit主要檢測 B、C1、D血清型的沙門氏菌，在歐洲、亞洲和美洲等地區(qū)廣泛使用。ELISA法檢出沙門氏菌的極限范圍在105～106cfu/mL，因此，要得出可靠的結(jié)果，食物樣品首先必需進(jìn)行預(yù)增菌、選擇性增菌，通常還要在含有D-甘露糖的肉湯（M肉湯）中進(jìn)行后增菌，以促進(jìn)鞭毛發(fā)育。總的來說，標(biāo)準(zhǔn)的ELISA法樣品的制備，約需要經(jīng)過40～48 h的孵育才能完成。樣品制備過程分3步：1）選用營養(yǎng)肉湯進(jìn)行預(yù)增菌，使致傷、冷凍的沙門氏菌復(fù)蘇；2）使用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行增菌，使沙門氏菌大量繁殖，同時抑制其他雜菌生長；3）使用營養(yǎng)肉湯（蛋白胨水）進(jìn)行后增菌，使沙門氏菌的數(shù)量大大增加。比上述標(biāo)準(zhǔn)的ELISA法樣品制備過程縮短了一半的時間。ELISA方法本身，則僅需要大約2 h而已（其中30 min是操作時間，90 min是孵育時間）。

最新的沙門氏菌免疫學(xué)檢測法利用經(jīng)特異性抗體敏化的免疫色譜卡片為基礎(chǔ)。幾滴樣品加到卡片上，結(jié)果可以直接用肉眼讀出。免疫色譜卡片極易操作，且由于無需要特殊設(shè)備，很適合小型實(shí)驗(yàn)室使用。盡管卡片檢測法與ELISA法一樣需要對樣品進(jìn)行增菌處理，但它（卡片法）本身通常需時不超過10 min。

文其乙[2]等建立了直接ELISA檢測沙門氏菌方法，從已獲得的4株沙門氏菌屬特異雜交瘤單克隆抗體中，篩選出CB8和De7兩株單抗相合成酶標(biāo)檢測試劑，并建立了檢測沙門氏菌的直接ELISA方法，它能檢出沙門氏菌屬99%的菌株，而不與其他腸道桿菌反應(yīng)（包括大腸桿菌、陰溝桿菌、產(chǎn)氣桿菌、志賀氏菌、枸櫞酸桿菌、克雷伯氏菌、變形桿菌和沙雷氏菌）。應(yīng)用本方法檢測糞樣、魚粉、奶樣，其敏感性和特異性分別高達(dá)100%和97.6%，僅出現(xiàn)2.4%的假陽性率，該法不受各種樣品成分的影響，而且在2～3 d即可完成樣品篩選。直接ELISA具有快速簡便、易于推廣的優(yōu)點(diǎn)。

殷月蘭[3]等建立了單抗競爭ELISA檢測豬沙門氏菌感染方法，以豬霍亂沙門氏菌為包被抗原，利用沙門氏菌O7單克隆抗體酶結(jié)合物建立了競爭ELISA方法檢測豬霍亂沙門氏菌抗體?？乖粷舛葹?2×108cfu/mL，血清檢測稀釋度為1∶16，酶標(biāo)抗體濃度為1∶700，包被液為碳酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH9.6）。應(yīng)用單抗競爭ELISA和平板凝集試驗(yàn)（PAT）同時對506份血清進(jìn)行豬霍亂抗體檢測，PAT的檢出率為3.60%，ELISA檢出率為5.75%，兩者符合率達(dá)96.4%。試驗(yàn)結(jié)果表明，ELISA方法敏感性高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，操作簡便。

黃素珍[4]等建立了檢測腸炎沙門氏菌的競爭ELISA方法，對210份腸炎沙門氏菌感染雞泄殖腔棉拭子、羽毛和組織樣品先篩選后鑒定的方法進(jìn)行檢測具有明顯的競爭抑制作用。通過與國標(biāo)法對大量的樣品檢測結(jié)果比較表明，競爭ELISA方法的檢出率為18.09%，檢出陽性樣品36份，國標(biāo)法檢出率為17.14%，兩者符合率為97.14%，競爭ELISA敏感性和特異性分別為94.4%和97.7%。

斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附（Dot-ELISA）試驗(yàn)是一項免疫學(xué)檢測技術(shù)，具有簡單、快速、敏感、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，并具有較高的可重復(fù)性。目前，應(yīng)用該法檢測食品中沙門氏菌的報道很多。張紅見[5]等應(yīng)用Dot-ELISA法對85份豬胴體進(jìn)行了沙門氏菌的檢測，結(jié)果表明，在85份肉樣中，Dot-ELISA檢出沙門氏菌陽性65份，陽性率為76.47%，檢測結(jié)果與常規(guī)方法一致?？得鱗6]等應(yīng)用Dot-ELISA檢測魚粉85份，結(jié)果表明，64份為陽性，常規(guī)分離培養(yǎng)法53份為陽性，2種方法差異不顯著。由此可見，該方法簡便、特異、快速、結(jié)果直觀，便于在基層推廣使用。

由于食品檢測樣品常為固液多相混合體，采用常規(guī)方法難以將少量致病微生物分離出來。借助免疫磁性分離技術(shù)，可以很快地在含有大量雜菌的懸液中有選擇性地分離出目的微生物，節(jié)省時間。目前，應(yīng)用該法分離檢驗(yàn)食品中的致病菌也有一些相關(guān)報道。Skjerve等報道了用免疫磁性分離技術(shù)從乳及乳制品、肉類和蔬菜中分離出沙門氏菌，其檢測限為每克100個細(xì)菌。Mansfield等通過比較免疫磁性分離技術(shù)和常規(guī)方法從食品中分離沙門氏菌，他們用120種食物樣品，其中一半樣品中加入低濃度的沙門氏菌[7]。結(jié)果證實(shí)，就選擇性而言，抗沙門氏菌磁珠和增菌方法中最有效的亞硒酸鹽選擇性培養(yǎng)基一樣有效。值得強(qiáng)調(diào)的是，免疫磁性分離技術(shù)能捕獲受損傷的靶細(xì)菌，而目前所用的幾種常規(guī)方法則不具備這樣的能力。

全自動熒光酶標(biāo)免疫分析儀對沙門氏菌的檢測鑒定結(jié)果比較成熟，并已先后被美國FDA、AOAC、USDA等部門認(rèn)可，我國學(xué)者也有相關(guān)研究報道?？苓\(yùn)同等利用自動熒光酶標(biāo)分析系統(tǒng)快速檢測出口動物性食品中沙門氏菌，結(jié)果表明，其靈敏度高，操作簡便，大大縮短檢驗(yàn)周期，可用于檢驗(yàn)出口動物性食品中沙門氏菌。陶軍[8]等利用法國生物-梅里埃公司提供的“自動酶標(biāo)免疫檢測儀”與常規(guī)培養(yǎng)法對凍肉中沙門氏菌進(jìn)行檢測，指出該儀器最大特點(diǎn)是對被檢細(xì)菌不需要純培養(yǎng)，只需在增菌培養(yǎng)基中即可檢出。黃玲[9]等利用自動酶標(biāo)免疫測試儀和國標(biāo)方法檢測食品中沙門氏菌，結(jié)果表明，該法具有靈敏度高、無傳染危險、檢測速度快等特點(diǎn)。陳煒[10]等運(yùn)用自動熒光酶標(biāo)分析儀和國家標(biāo)準(zhǔn)方法分別對同一種脫水蔬菜樣品中沙門氏菌進(jìn)行檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行對比，表明運(yùn)用自動熒光酶標(biāo)分析儀檢測脫水蔬菜中的沙門氏菌靈敏度高、速度快，完全滿足檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)快速檢測的需要。

Munron應(yīng)用自動熒光抗體檢測系統(tǒng)檢測食品中的沙門氏菌，每小時能檢測到120個玻片樣品，與常規(guī)試驗(yàn)比較，準(zhǔn)確率達(dá)96%。Kyrinr和heimarch用熒光抗體檢測系統(tǒng)檢測食品中的沙門氏菌，該系統(tǒng)可同時檢測14個樣品，并且結(jié)果可靠，操作簡單。Cloak等利用表面吸附將檢測樣品吸附于玻璃表面的一種薄膜上，然后用免疫熒光顯微鏡進(jìn)行結(jié)果判定。該方法檢測限為103～105cfu/mL，且不呈現(xiàn)假陰性與假陽性反應(yīng)。

英國Matrix公司是一家專業(yè)從事致病菌快速檢測系統(tǒng)研究、開發(fā)和生產(chǎn)的專業(yè)公司，其采用的免疫磁分離（IMS）方法快速檢測致病菌系統(tǒng)，是目前世界上速度最快的致病菌檢測方法之一。該方法已經(jīng)獲得美國AOAC認(rèn)證，具有高靈敏度、高特異性、高穩(wěn)定性、無污染、無毒性、檢測迅速等特點(diǎn)。它采用一種合成磁性材料—微磁珠，磁珠表面進(jìn)行基團(tuán)修飾并鍵合連接臂，將多克隆抗體或單克隆抗體連接后進(jìn)行包被，制成帶磁性的免疫抗體。磁性抗體可以選擇性吸附流動樣品中的目標(biāo)抗原，借助外磁場的作用吸附在捕獲區(qū)，實(shí)現(xiàn)對大容量樣品中微生物的快速免疫濃縮純化。

在抗原富集問題上，也有利用單克隆抗體標(biāo)記磁珠方法，直接將樣品與標(biāo)記磁珠混合，再進(jìn)行下一步ELISA檢測。MaxSignalTM沙門氏菌酶聯(lián)免疫檢測試劑盒為國家管理部門、食品生產(chǎn)商、質(zhì)檢部門提供了方便有效的方法，檢測水平為 105cfu/mL。

2.2 以核酸為基礎(chǔ)的方法

2.2.1 核酸雜交

細(xì)胞核酸DNA和RNA是一類可以攜帶生物信息的大分子。由于所有的細(xì)胞都含有這類分子，可以利用它作為檢測的標(biāo)靶。標(biāo)靶通常是一個特異性核酸序列，能夠結(jié)合核酸分子作為探針。與免疫學(xué)方法相似，探針也需要附加適當(dāng)?shù)臉?biāo)記，如放射性同位素、酶或發(fā)光的標(biāo)記物。Fitts等人1983年在食品沙門氏菌檢測中引入了第1代DNA-RNA雜交技術(shù)，此法應(yīng)用的探針含有用放射性同位素標(biāo)記的傷寒沙門氏菌DNA片段，其敏感性高，經(jīng)大約48 h的增菌步驟后，檢測極限可達(dá)108cfu/mL，但由于要使用放射性同位素，只能在專門的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。為此，發(fā)展了以核酸雜交為基礎(chǔ)的第2代技術(shù)——比色計。這種方法依賴于沙門氏菌核糖體RNA（rRNA）-核糖體發(fā)育過程中儲存的核酸成分的檢測[11]。核糖體是細(xì)胞蛋白質(zhì)合成器的一部分，每個細(xì)菌細(xì)胞中存在 5 000 ～ 20 000 個復(fù)制體，而相比之下染色體DNA復(fù)制體僅為2～10個。這種天然富含rRNA標(biāo)靶序列的情況使得用其他方法檢測成為可能，同時又保持了與放射性同位素方法相當(dāng)或更高的敏感性。其另一優(yōu)點(diǎn)是由于rRNA為單鏈（而DNA為雙鏈），雜交前無需經(jīng)過變性步驟。要得到陽性結(jié)果，此法需要105cfu/mL，因此對沙門氏菌檢測來說，需要進(jìn)行預(yù)增菌和選擇性增菌，總共約50 h。rRNA探針法比沙門氏菌ELISA法（酶聯(lián)免疫檢測法）更耗時，但二者成本相近。食品細(xì)菌檢測法的最新進(jìn)展是在化學(xué)擴(kuò)增體系方面，即聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），用該體系可對制備好的樣品進(jìn)行細(xì)菌DNA擴(kuò)增，以便更易于用諸如凝膠電泳法或比色型ELISA法檢測。用于檢測沙門氏菌和其他以食物為載體的病原的PCR方法也已建立，其中一些方法顯示了極好的敏感性。但該法較難自動化，且必需經(jīng)選擇性增菌以稀釋可能干擾檢測反應(yīng)的某些成分。一個完整的以PCR為基礎(chǔ)的方法，需要2 d才能完成，很大程度上抵消了其高敏感性的優(yōu)點(diǎn)，但這種方法對那些含沙門氏菌較少或沙門氏菌“致傷”嚴(yán)重難以復(fù)蘇而仍保有沙門氏菌rRNA的樣品尤其有效。

2.2.2 PCR 法

Rahn等首先設(shè)計出一對引物，用PCR檢測沙門氏菌，檢出率為97%，但許多腸道桿菌能同時擴(kuò)增出來，特異性較差。此后，國內(nèi)外許多學(xué)者進(jìn)行了利用PCR技術(shù)檢測沙門氏菌的研究。Nguyen等根據(jù)腸炎沙門氏菌C7克隆株具有的屬特異性序列設(shè)計出一對引物，能快速地檢出肉食品標(biāo)本中的沙門氏菌，檢測的敏感性和特異性均為100%，保證了檢測的準(zhǔn)確性。此外，我國盧強(qiáng)[12]等將自己建立的PCR擴(kuò)增invA基因特異性檢測沙門氏菌的方法用于食品樣品中沙門氏菌的檢測，并結(jié)合辣根過氧化物酶直接標(biāo)記基因探針技術(shù)和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)（ECL）技術(shù)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Slot-blot雜交，新建立了PCR-ECL沙門氏菌檢測方法，檢測限可達(dá)10 cfu/g，是一種有前途的快速檢測食品中沙門氏菌的方法。章新生[13]等根據(jù)寡核苷酸序列合成一對引物用于沙門氏菌的檢測，并對其特異性和擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了驗(yàn)證。黃金林[14]等根據(jù)沙門氏菌組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子基因序列設(shè)計引物序列，成功擴(kuò)增出495 bp沙門氏菌特異條帶，而陰性對照則無此條帶，從而建立了應(yīng)用PCR進(jìn)行沙門氏菌快速檢測的方法。應(yīng)用該方法對沙門氏菌屬A-F各群中共15株沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、27株沙門氏菌現(xiàn)場分離菌株和其他10株非沙門氏菌菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果沙門氏菌均顯示出495 bp特異性DNA擴(kuò)增條帶，而所有對照均不出現(xiàn)特異條帶，因此，此方法具有很強(qiáng)的沙門氏菌屬特異性。PCR敏感性試驗(yàn)顯示，該體系能檢出14 pg以上的沙門氏菌DNA。汪琦等[15]利用PCR方法快速檢測食品中的沙門氏菌。以全脂奶粉、生牛肉和加工過的雞肉為實(shí)驗(yàn)對象，人為添加沙門氏菌，檢測結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法系統(tǒng)檢測結(jié)果一致。檢出限為 100 cfu/25 g，準(zhǔn)確性達(dá) 100%。

2.2.3 基因芯片技術(shù)

Chizhikov等采用寡核苷酸芯片研究沙門氏菌抗原和毒力因子與其致病性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌毒力因子可用于腸道致病菌的分析檢測。靳連群等利用基因芯片技術(shù)檢測腸道中沙門氏菌等致病菌。結(jié)果顯示制備的基因芯片能夠檢測出致病菌，對于未知菌落利用基因芯片能夠在3 h完成對未知菌屬的鑒定。

2.2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP） 是一種在等溫條件下高特異、高效、快速地擴(kuò)增靶序列的DNA擴(kuò)增新技術(shù)。以沙門氏菌為研究對象，根據(jù)其特異性的invA基因，設(shè)計了一套特異性引物對該基因進(jìn)行了LAMP，同時優(yōu)化了其反應(yīng)條件，建立了沙門氏菌的LAMP快速檢測技術(shù)。結(jié)果表明，LAMP的最佳反應(yīng)條件為外引物濃度5 pmol/L、內(nèi)引物濃 度 40 pmol/L，Mg2+濃 度 6 mmol/L，dNTP 濃度 0.8 mmol/L，甜菜堿濃度0.8 mmol/L，Bst DNA 聚合酶 8U，反應(yīng)溫度63 ℃，反應(yīng)時間1 h。在此條件下，LAMP檢測沙門氏菌DNA的敏感度達(dá)10 fg，且與其他常見的細(xì)菌無交叉反應(yīng)。其對牛奶樣品的檢出量為102cfu/mL，適合于食品中污染沙門氏菌的快速檢測[16-17]。

圖1 Real-time?PCR?有很好的重復(fù)性

圖2 Real-time?PCR 特異性及濃度梯度

圖3 Real-time?PCR 所制的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.5 實(shí)時定量 PCR

實(shí)時熒光定量PCR（Realtime PCR） 技 術(shù) 于 1996 年 由 美 國Applied Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5′-3′外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術(shù)平臺。現(xiàn)在作為檢測的基因有invA、stn、tyv、prt、viaB、flic-d/ flic-a、bipA 和 fimA。理論上只要有1個沙門氏菌就能檢測出，但在實(shí)踐中，一般能檢測出5個沙門氏菌[18]。

磁珠富集與實(shí)時定量PCR，利用抗體標(biāo)記的磁珠對沙門氏菌富集，進(jìn)一步提高靈敏度。

3 其他檢測方法

3.1 電阻抗法

阻抗法是幾種方法中最少受到主觀因素干擾的方法。我國陳廣全等[19]用電阻抗法檢測食品中的沙門氏菌。經(jīng)與常規(guī)培養(yǎng)法進(jìn)行比較，對加入食品中的21種已知沙門氏菌屬檢測，電阻抗法19個為陽性，檢出率在90%以上，檢測結(jié)果與常規(guī)培養(yǎng)法一致，對于陰性結(jié)果能在48 h內(nèi)得出。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明電阻抗法能夠快速、可靠地檢測食品中沙門氏菌。

3.2 沙門氏菌毒素快速檢驗(yàn)法

本法是根據(jù)沙門氏菌等腸科桿菌具有產(chǎn)生內(nèi)毒素的特點(diǎn)，采用氧化呈色反應(yīng)進(jìn)行的快速檢驗(yàn)。在被檢肉浸液中，若含內(nèi)毒素，加入的硝酸銀使毒素氧化成氧化型毒素，氧化型毒素和加入肉浸液中的美藍(lán)牢固結(jié)合，當(dāng)再向肉浸液中加入高錳酸鉀時，美藍(lán)不與高錳酸鉀作用，使肉浸液呈藍(lán)綠色。

3.3 4-甲基傘形酮辛酯檢測法

4-甲基傘形酮辛酯（MUCAP）檢測法是利用沙門氏菌具有其他各屬細(xì)菌都不具備的產(chǎn)生辛酯酶的特性，選用相應(yīng)的底物和指示劑，將其配制在相關(guān)的培養(yǎng)基中，根據(jù)沙門氏菌反應(yīng)后出現(xiàn)的明顯顏色變化，而確定待檢可疑菌株[20]。

3.4 葡萄球菌A蛋白協(xié)凝試驗(yàn)法

Staphylococcal Protein A 簡稱 SPA即葡萄球菌A蛋白。目前，國外已將SPA用于沙門氏菌的快速檢驗(yàn)，所用的葡萄球菌菌株多為CowanⅠ株。國內(nèi)應(yīng)用該法檢驗(yàn)食品中沙門氏菌報道很少，曹同雪等采用SPA協(xié)凝試驗(yàn)法檢測100個肉樣中的沙門氏菌，結(jié)果表明該法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、檢出率高并且節(jié)省費(fèi)用[21]。

3.5 生物傳感器

使用集成化手持式SpreetaTM SPR傳感器快速檢測沙門氏菌，利用親和素-生物素系統(tǒng)保證了檢測的準(zhǔn)確性；同時利用沙門氏菌抗體的免疫吸附反應(yīng)，保證了結(jié)果的特異性；并引入復(fù)合抗體作為第二抗體以擴(kuò)大檢測的響應(yīng)信號，檢測到鼠傷寒沙門氏菌的濃度為105cfu/mL，整個檢測過程在1 h內(nèi)完成，從一定程度上實(shí)現(xiàn)了食品中病原微生物的快速檢測[22]。

沙門氏菌作為食品衛(wèi)生檢驗(yàn)一項重要目標(biāo)菌，其檢測方法的研究有著重要意義。提高沙門氏菌檢測靈敏度，縮短檢測時間、簡化檢測程序，使沙門氏菌檢測方法向自動化、快速化、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、簡易、經(jīng)濟(jì)等方向不斷發(fā)展。隨著社會發(fā)展與科技進(jìn)步，新的微生物檢驗(yàn)方法和手段不斷涌現(xiàn)，這些檢測方法的檢測結(jié)果與傳統(tǒng)檢測方法大體一致，能夠快速、可靠的檢測出食品中的沙門氏菌。

[1] 張玉臣，閆文菊.沙門氏菌食物中毒[J].社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志，2006（12）：10-11.

[2] 文其乙，焦新安.直接ELISA檢測沙門氏菌方法的建立及其應(yīng)用研究[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，1995，15（2）：105-111.

[3] 殷月蘭，潘志明，焦新安，等.單抗競爭ELISA檢測豬沙門氏菌感染方法的建立與應(yīng)用[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2003（1）：65-68.

[4] 黃素珍，杜元釗，張艷紅，等.檢測腸炎沙門氏菌ELISA方法的建立與應(yīng)用研究 [J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2006，28（2）：197-200.

[5] 張紅見，韓志輝，魏建華，等.Dot-ELISA檢測豬胴體中沙門氏菌的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2003（11）：8-9.

[6] 康明，韓志輝，李剛，等.Dot-ELISA法檢測魚粉中沙門氏菌的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2004（7）：58-59.

[7] Mansfield L P，F(xiàn)orsythe S J.The detecti on of Salmonella serovars from animal fee d and raw chicken using a combined immunomagnetic separation and ELISA meth od[J].Food Microbiology，2001（18）：361-366.

[8] 陶軍，張樹宏，吳仲梁.自動熒光酶標(biāo)免疫測試儀與常規(guī)培養(yǎng)法對凍禽肉中沙門氏菌的檢測效果的比較[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器，2001（3）：50-53.

[9] 黃玲，孟冬麗.利用mini-VIDAS和GB方法檢測食品中沙門氏菌的比較試驗(yàn)[J].新疆師范大學(xué)學(xué)報自然科學(xué)版，2003，22（1）：50-52.

[10] 陳煒，王德軍，馬巧蘭，等.脫水蔬菜中沙門氏菌不同檢測方法的對比研究[J].寧夏農(nóng)林科技，2003（1）：24-25.

[11] Torpdahl M ， Sorensen G ，Lindstedt B-A，et al.Tandem repeat analysis for surveillance of human S almonella Typhimurium infections[J].Emerg Infect Dis，2007，13 ：388-395.

[12] 盧強(qiáng)，陳貴連，林萬明.應(yīng)用PCRECL技術(shù)檢測食品中的沙門氏菌[J].中國公共衛(wèi)生，1995，11（4）：189-193.

[13] 章新生，臧富妍.應(yīng)用PCR技術(shù)檢測沙門氏菌[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，1999，19（2）:147-151.

[14] 黃金林，焦新安，潘志明，等.應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測沙門氏菌[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2002，2（3）：5-11.

[15] 汪琦，張昕，張惠媛，等.利用PCR方法快速檢測食品中的沙門氏菌[J].檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2005，15（6）：26-28.

[16] 朱勝梅，吳佳佳，徐馳，等.環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)快速檢測沙門菌[J].現(xiàn)代食品科技，2008，24（7）：725-730.

[17] Cook N.The use of NASBA for the detection of microbial pathogens in food and environmental samples[J].J Appl Microbiol，2003，53 ：165-174.

[18] Malorny B ， Paccassoni E ，F(xiàn)ach P， et al. Diagnostic realtime PCR of Salmonella in food[J].Appl Environ Microbiol，2004，70 ：7046-7052.

[19] 陳廣全，張惠嬡，饒紅，等.電阻抗法檢測食品中沙門氏菌[J].食品科學(xué)，2001，22（9）：66-70.

[20] 褚天新，蘇麗霞，路文彬.MUCAP熒光試驗(yàn)快速檢測沙門氏菌[J].中國公共衛(wèi)生，2000（1）：69-70.

[21] 曹同雪，唐中令，石如彥，等.SPA協(xié)凝試驗(yàn)法快速檢驗(yàn)肉中沙門氏菌[J].肉品衛(wèi)生，1997（6）:1-5.

[22] 王凱，殷涌光.SPR生物傳感器快速檢測沙門氏菌研究初探[J].食品科技，2007，（9）：191-95.