耿士忠，潘志明，劉 杰，劉志成，方 強(qiáng)，焦新安

（揚(yáng)州大學(xué)江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009）

沙門(mén)氏菌是常見(jiàn)的人和動(dòng)物的重要病原菌之一，呈全球性分布。多種沙門(mén)氏菌均可感染豬，主要包括：海德堡沙門(mén)氏菌（Salmonlla heidelberg）、華盛頓沙門(mén)菌（Salmonlla worthington）、鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonlla typhimurium）、鼠傷寒沙門(mén)氏菌哥本哈根變種（S.typhimurium-var.copenhagen）、新生兒德?tīng)柋吧抽T(mén)氏菌（Salmonlla derby）、 嬰 兒 沙 門(mén) 氏 菌（Salmonlla infantis），以及乙型副傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonlla paratyphi B）、斯坦利沙門(mén)氏菌（Salmonlla stanley）、雷根特沙門(mén)氏菌（Salmonella regent）、豬霍亂沙門(mén)氏 菌（Salmonlla choleraesuis）、 腸 炎沙門(mén)氏菌（Salmonella enteritidis）等血清型。其中豬霍亂沙門(mén)氏菌和德?tīng)柋吧抽T(mén)氏菌對(duì)豬具有宿主適應(yīng)性，感染母豬可長(zhǎng)時(shí)間攜帶病原。世界上最大的一起由沙門(mén)氏菌引起的食物中毒，1953年發(fā)生在瑞典，是由食用豬肉而引起的鼠傷寒沙門(mén)氏菌中毒，導(dǎo)致7 717人中毒，90人死亡。由于沙門(mén)氏菌菌型、菌株不同，致人發(fā)病的菌量也不同，一般使人發(fā)病的菌量平均為107cfu以上。鼠傷寒沙門(mén)氏菌是最常見(jiàn)的血清型，在國(guó)外占27.7%～80%，其次為腸炎沙門(mén)氏菌占10.3%。某省10年來(lái)的統(tǒng)計(jì)資料顯示豬在屠宰前感染沙門(mén)氏菌是比較嚴(yán)重的，其檢出率高達(dá)26.5%。由于帶菌率高，在屠宰加工過(guò)程中，往往可造成豬肉污染，豬肉的沙門(mén)氏菌檢出率為12.5%。肉類(lèi)食品從宰殺到烹調(diào)加工的各個(gè)環(huán)節(jié)中，都可受到污染。烹調(diào)后的熟肉，如果再次受到污染，并且在較高的溫度下保存，食用前又不再加熱，則更為危險(xiǎn)。有些細(xì)菌主要在生長(zhǎng)豬以及一些母豬的腸道內(nèi)繁殖。感染豬可連續(xù)數(shù)周甚至數(shù)月從糞便中排出病原，而不表現(xiàn)任何癥狀。在屠宰的時(shí)候，豬腸道中的沙門(mén)氏菌可能污染胴體，導(dǎo)致人類(lèi)食物中毒，對(duì)公共健康構(gòu)成潛在威脅。有些細(xì)菌如豬霍亂和豬傷寒沙門(mén)氏菌，可引起仔豬發(fā)病，是仔豬的一種較常見(jiàn)的腸道傳染病，而在成年豬中很少發(fā)生。該病在各地豬場(chǎng)均有發(fā)生，特別是在衛(wèi)生條件差的豬場(chǎng)常有發(fā)生，給養(yǎng)殖業(yè)造成很大損失。此病主要危害1～4月齡斷奶仔豬，所以是規(guī)?；i場(chǎng)提高仔豬成活率與經(jīng)濟(jì)效益的大敵[1]。由于這些沙門(mén)氏菌是多種豬肉產(chǎn)品的污染源，因而豬的沙門(mén)氏菌病備受關(guān)注，全世界所有國(guó)家都非常重視沙門(mén)氏菌控制。

沙門(mén)氏菌主要寄生于人和動(dòng)物的腸道中，但由于其在環(huán)境中具有較強(qiáng)的生存能力，所以在環(huán)境中也廣泛存在，常見(jiàn)于農(nóng)場(chǎng)的污水、人類(lèi)生產(chǎn)的污物以及被糞便污染的物體中。該細(xì)菌通常由亞臨床感染動(dòng)物的排泄物通過(guò)施肥或澆灌等方式造成環(huán)境源性污染，造成水果蔬菜等二次污染，引起人間接感染，或者引起食源性污染，如肉、蛋、奶等直接污染，引起人因食用污染食物而感染，并致人腹瀉或系統(tǒng)性疾病。豬沙門(mén)氏菌病引起的嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，對(duì)豬肉的食品安全及國(guó)際貿(mào)易形成較大威脅。因此對(duì)豬沙門(mén)氏菌的檢測(cè)及診斷就顯得至關(guān)重要。

自19世紀(jì)后期，沙門(mén)氏菌首次被鑒定為人類(lèi)的一種病原以來(lái)，檢測(cè)方法學(xué)都是建立在采集感染動(dòng)物或患病者的糞便或血液作為臨床病料的基礎(chǔ)上。此后的60年間，用于從食品中分離沙門(mén)氏菌的方法實(shí)質(zhì)上與那些用于臨床病料的方法是相同的。但至少有3個(gè)因素限制了用于臨床病料的方法應(yīng)用在食品分析上。第一，通常，沙門(mén)氏菌的含量水平在污染食品中比在感染病人的病料中要低很多；第二，食品本身的性質(zhì)會(huì)干擾病原的檢測(cè)，例如，某些食品中固有菌群可能處在一個(gè)很高的水平，從而影響特定細(xì)菌的選擇性分離和鑒定；第三，與臨床病料不同的是，經(jīng)過(guò)加工的食品，由于加熱、干燥、高含鹽量、酸和冷凍等因素的作用，其中的沙門(mén)氏菌受到了尚不致命的損傷或稱(chēng)“致傷”，這就形成了一個(gè)具有不同生長(zhǎng)特性的細(xì)菌群，這種現(xiàn)象對(duì)那些希望從食物樣品中分離出沙門(mén)氏菌的食品分析家來(lái)說(shuō)有很大影響，因?yàn)樵谶x擇培養(yǎng)基上直接培養(yǎng)“致傷”的沙門(mén)氏菌通常是以細(xì)菌死亡和試驗(yàn)失敗而告終。為克服這些困難，人們建立了一種簡(jiǎn)單的微生物增殖步驟，專(zhuān)門(mén)針對(duì)以食品為傳播載體的病原。雖然這些方法本身證明是可靠的，但卻很費(fèi)力、耗時(shí)，需要3～6 d才能完成。因此，在需要及時(shí)、快速評(píng)價(jià)食品中微生物的安全性時(shí)，通常不被采用。隨著DNA和單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展，近幾十年間發(fā)展了許多改進(jìn)的方法，其中一些方法可以在12～24 h內(nèi)檢出沙門(mén)氏菌，這些方法通稱(chēng)為快速檢測(cè)。

圖1 脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)儀

圖2 實(shí)時(shí)定量PCR儀

圖3 磁分選儀

1 直接法——傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法

用于檢測(cè)沙門(mén)氏菌的傳統(tǒng)方法是將食物樣品分步增菌，以提高病原菌的檢出率。這種培養(yǎng)方法總體可分為3個(gè)不同階段，預(yù)增菌、選擇性增菌及分離步驟。傳統(tǒng)沙門(mén)氏菌檢測(cè)法全過(guò)程需時(shí)至少4～7 d，才能得出明確的診斷結(jié)果。GB 4789.4-94是目前我國(guó)規(guī)定的對(duì)畜產(chǎn)品中沙門(mén)氏菌的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，主要是根據(jù)沙門(mén)氏菌的生化特性，進(jìn)行預(yù)增菌、選擇性增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定和血清分型5個(gè)步驟。在檢測(cè)畜產(chǎn)品過(guò)程中，應(yīng)注意根據(jù)不同的樣品采取不同的檢測(cè)步驟。第1步預(yù)增菌，不表現(xiàn)臨床癥狀的動(dòng)物糞便、環(huán)境樣品、動(dòng)物飼料和食物中的沙門(mén)氏菌數(shù)量通常很低，必須使用預(yù)增菌培養(yǎng)基（如緩沖蛋白胨水），它能使少量的沙門(mén)氏菌增殖，以利于細(xì)菌分離，或使用普通預(yù)增菌液以幫助細(xì)菌分離。將樣品添加到一種高營(yíng)養(yǎng)、無(wú)選擇性的培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，有助于因被冷凍、加熱、干燥或生物試劑等因素而致于瀕死的沙門(mén)氏菌復(fù)蘇。預(yù)增菌對(duì)較少的生長(zhǎng)較活潑的沙門(mén)氏菌可能不是最好的方法，如來(lái)自糞便的熱適應(yīng)菌株，因?yàn)樵诜沁x擇性預(yù)增菌過(guò)程中，競(jìng)爭(zhēng)性細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)快而難以分離。第2步是選擇性增菌步驟，它能選擇性地使沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)，而抑制其他細(xì)菌的生長(zhǎng)，有時(shí)也對(duì)某些血清型的沙門(mén)氏菌有抑制和致死作用，如亞硒酸能抑制和致死豬霍亂沙門(mén)氏菌，亮綠對(duì)都柏林沙門(mén)氏菌有害。除了在培養(yǎng)基中添加特定成分外，還常常用提高溫度的方法來(lái)增加增菌培養(yǎng)基的選擇性，不少實(shí)驗(yàn)室采用的溫度為43 ℃。目前應(yīng)用的培養(yǎng)基主要有如下幾種類(lèi)型：含四磺酸鈉的Muller-Kauffman肉湯、亞硒酸鹽F-亞硒酸鹽半胱氨酸-亮綠磺、Rappaport-Vassiliadis培養(yǎng)基或半固體Rappaport-Vassiliadis培養(yǎng)基、連四硫基鹽肉湯（Tetrathionate broth）、硒酸鹽胱氨酸肉湯（Selenitecystinebroth），現(xiàn)在Rappaport-Vassiliadis培養(yǎng)基的推薦溫度為41.5 ℃。活力選擇增菌培養(yǎng)基用來(lái)增加沙門(mén)氏菌的敏感性，半固體培養(yǎng)基，如MSRV或DIASALM（診斷用半固體培養(yǎng)基）可以提供更好的選擇性。由于沒(méi)有任何一種培養(yǎng)基可以全面地保持所有食品基質(zhì)或各種沙門(mén)氏菌血清型，所以，較適當(dāng)?shù)淖龇ň褪鞘褂?種培養(yǎng)基平行地進(jìn)行試驗(yàn)。從某種程度上講，使用多種選擇性培養(yǎng)基或通過(guò)預(yù)增菌培養(yǎng)后，直接選擇性增菌、直接涂板會(huì)更有利。第3步選擇性平板培養(yǎng)，作為選擇性固體培養(yǎng)基，能進(jìn)行不同程度的鑒別培養(yǎng)，能抑制其他細(xì)菌生長(zhǎng)，并能提供沙門(mén)氏菌的一些主要生化鑒別特征：無(wú)乳糖發(fā)酵和硫化氫產(chǎn)生，37 ℃培養(yǎng)24～48 h后判定結(jié)果。在這種培養(yǎng)基上，沙門(mén)氏菌形成特征性菌落，據(jù)此通?？膳c其他細(xì)菌菌落相區(qū)別。現(xiàn)在有一種較寬范圍的顯色培養(yǎng)基可以方便使用。有許多這樣的培養(yǎng)基有助于分離可疑菌落，但是必須確認(rèn)樣品的基體、培養(yǎng)系統(tǒng)和血清型，因?yàn)樵谀承┉h(huán)境下，細(xì)菌的感受性是很差的。第4步是分離鑒定步驟，即選擇性培養(yǎng)物在含一種或多種抑制非沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)制劑的瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，然后對(duì)平板上肉眼可見(jiàn)的特征性可疑菌落進(jìn)行確認(rèn)，并將可疑菌落在選擇和非選擇性瓊脂上作繼代培養(yǎng)，對(duì)該菌落分離物進(jìn)行一系列生化和血清學(xué)檢測(cè)，以作出鑒定。鑒定O、H抗原和在特定的情況下鑒定Vi抗原，可用特異抗血清進(jìn)行直接平板凝集試驗(yàn)。在具有雙相菌的情況下，應(yīng)通過(guò)含已知相抗血清的半固體培養(yǎng)基傳代，用相轉(zhuǎn)化法鑒定2個(gè)相，盡可能使用抗多種因子的抗血清加速篩選，因?yàn)閱我蜃友迥芨M(jìn)一步純化細(xì)菌。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室能鑒定較為普通的血清型，而進(jìn)一步鑒定某菌株應(yīng)參考實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備。傳統(tǒng)沙門(mén)氏菌檢測(cè)法全過(guò)程需時(shí)至少4～7 d，才能得出明確的診斷結(jié)果。

噬菌體對(duì)細(xì)菌有特殊的裂解作用。Thal-Kalings對(duì) 1181 株 沙 門(mén) 氏 菌 和323株其他菌株進(jìn)行沙門(mén)氏菌噬菌體O-I裂解試驗(yàn)，結(jié)果表明沙門(mén)氏菌裂解率為99.5%，而非沙門(mén)氏菌裂解率為0.3%。截至到1973年，Keils及Seeliger等人通過(guò)大量觀察證實(shí)，沙門(mén)氏菌屬內(nèi)裂解率在95.0%～99.6%之間，屬外誤差為0%～2.33%之間。何曉青等發(fā)現(xiàn)一種腸桿菌科分屬診斷噬菌體，其鑒定沙門(mén)氏菌只要6 min，加上培養(yǎng)菌落時(shí)間只需2 d。張碧波等應(yīng)用噬菌體快速檢測(cè)沙門(mén)氏菌，對(duì)100個(gè)腸桿菌菌株進(jìn)行噬菌體O-I裂解試驗(yàn)，30株沙門(mén)氏菌全部為陽(yáng)性，而其余非沙門(mén)氏菌株全部為陰性，與前人研究結(jié)果一致。由此可見(jiàn)，應(yīng)用沙門(mén)氏菌噬菌體O-I對(duì)沙門(mén)氏菌進(jìn)行檢測(cè)方便可靠。

2 間接法

2.1 以抗體為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法

利用抗原—抗體反應(yīng)的顯著特異性，來(lái)進(jìn)行細(xì)菌的鑒別和血清學(xué)定型，已有半個(gè)多世紀(jì)的歷史。細(xì)菌菌體或鞭毛抗原的特異性抗體的存在，使得人們可以建立一些快速方法來(lái)檢測(cè)以食品為載體的病原。已經(jīng)建立的沙門(mén)氏菌免疫學(xué)檢測(cè)方法有許多種，大致可分為以酶標(biāo)抗體（ELISA）、熒光抗體染色（免疫熒光法）、同位素標(biāo)記抗體（放射免疫試驗(yàn)）為基礎(chǔ)的方法及其他多種以抗體為基礎(chǔ)，利用乳膠凝集、免疫傳感器、免疫擴(kuò)散及免疫色譜技術(shù)的方法。但最廣泛采用的是以雙位點(diǎn)ELISA技術(shù)即夾心ELISA為基礎(chǔ)的方法。此法改進(jìn)后用化學(xué)發(fā)光替代標(biāo)記抗體，概括地說(shuō)，是以固定在固體基質(zhì)上的“捕捉”抗體來(lái)捕捉目標(biāo)抗原，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的成分，加入第2種酶標(biāo)抗體，此者結(jié)合在捕捉到的抗原的不同位點(diǎn)上，第2次洗滌后加入酶作用基質(zhì)，并令其與顏色成分反應(yīng)，然后用分光光度法即很容易檢測(cè)到目標(biāo)抗原。采用微量滴定板作為固態(tài)基質(zhì)使反應(yīng)形式標(biāo)準(zhǔn)化，并促成其自動(dòng)化。

HerdChek Swine Salmonella Antib ody Test Kit主要檢測(cè) B、C1、D血清型的沙門(mén)氏菌，在歐洲、亞洲和美洲等地區(qū)廣泛使用。ELISA法檢出沙門(mén)氏菌的極限范圍在105～106cfu/mL，因此，要得出可靠的結(jié)果，食物樣品首先必需進(jìn)行預(yù)增菌、選擇性增菌，通常還要在含有D-甘露糖的肉湯（M肉湯）中進(jìn)行后增菌，以促進(jìn)鞭毛發(fā)育?？偟膩?lái)說(shuō)，標(biāo)準(zhǔn)的ELISA法樣品的制備，約需要經(jīng)過(guò)40～48 h的孵育才能完成。樣品制備過(guò)程分3步：1）選用營(yíng)養(yǎng)肉湯進(jìn)行預(yù)增菌，使致傷、冷凍的沙門(mén)氏菌復(fù)蘇；2）使用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行增菌，使沙門(mén)氏菌大量繁殖，同時(shí)抑制其他雜菌生長(zhǎng)；3）使用營(yíng)養(yǎng)肉湯（蛋白胨水）進(jìn)行后增菌，使沙門(mén)氏菌的數(shù)量大大增加。比上述標(biāo)準(zhǔn)的ELISA法樣品制備過(guò)程縮短了一半的時(shí)間。ELISA方法本身，則僅需要大約2 h而已（其中30 min是操作時(shí)間，90 min是孵育時(shí)間）。

最新的沙門(mén)氏菌免疫學(xué)檢測(cè)法利用經(jīng)特異性抗體敏化的免疫色譜卡片為基礎(chǔ)。幾滴樣品加到卡片上，結(jié)果可以直接用肉眼讀出。免疫色譜卡片極易操作，且由于無(wú)需要特殊設(shè)備，很適合小型實(shí)驗(yàn)室使用。盡管卡片檢測(cè)法與ELISA法一樣需要對(duì)樣品進(jìn)行增菌處理，但它（卡片法）本身通常需時(shí)不超過(guò)10 min。

文其乙[2]等建立了直接ELISA檢測(cè)沙門(mén)氏菌方法，從已獲得的4株沙門(mén)氏菌屬特異雜交瘤單克隆抗體中，篩選出CB8和De7兩株單抗相合成酶標(biāo)檢測(cè)試劑，并建立了檢測(cè)沙門(mén)氏菌的直接ELISA方法，它能檢出沙門(mén)氏菌屬99%的菌株，而不與其他腸道桿菌反應(yīng)（包括大腸桿菌、陰溝桿菌、產(chǎn)氣桿菌、志賀氏菌、枸櫞酸桿菌、克雷伯氏菌、變形桿菌和沙雷氏菌）。應(yīng)用本方法檢測(cè)糞樣、魚(yú)粉、奶樣，其敏感性和特異性分別高達(dá)100%和97.6%，僅出現(xiàn)2.4%的假陽(yáng)性率，該法不受各種樣品成分的影響，而且在2～3 d即可完成樣品篩選。直接ELISA具有快速簡(jiǎn)便、易于推廣的優(yōu)點(diǎn)。

殷月蘭[3]等建立了單抗競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)豬沙門(mén)氏菌感染方法，以豬霍亂沙門(mén)氏菌為包被抗原，利用沙門(mén)氏菌O7單克隆抗體酶結(jié)合物建立了競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)豬霍亂沙門(mén)氏菌抗體?？乖粷舛葹?2×108cfu/mL，血清檢測(cè)稀釋度為1∶16，酶標(biāo)抗體濃度為1∶700，包被液為碳酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH9.6）。應(yīng)用單抗競(jìng)爭(zhēng)ELISA和平板凝集試驗(yàn)（PAT）同時(shí)對(duì)506份血清進(jìn)行豬霍亂抗體檢測(cè)，PAT的檢出率為3.60%，ELISA檢出率為5.75%，兩者符合率達(dá)96.4%。試驗(yàn)結(jié)果表明，ELISA方法敏感性高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便。

黃素珍[4]等建立了檢測(cè)腸炎沙門(mén)氏菌的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，對(duì)210份腸炎沙門(mén)氏菌感染雞泄殖腔棉拭子、羽毛和組織樣品先篩選后鑒定的方法進(jìn)行檢測(cè)具有明顯的競(jìng)爭(zhēng)抑制作用。通過(guò)與國(guó)標(biāo)法對(duì)大量的樣品檢測(cè)結(jié)果比較表明，競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的檢出率為18.09%，檢出陽(yáng)性樣品36份，國(guó)標(biāo)法檢出率為17.14%，兩者符合率為97.14%，競(jìng)爭(zhēng)ELISA敏感性和特異性分別為94.4%和97.7%。

斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附（Dot-ELISA）試驗(yàn)是一項(xiàng)免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，具有簡(jiǎn)單、快速、敏感、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，并具有較高的可重復(fù)性。目前，應(yīng)用該法檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌的報(bào)道很多。張紅見(jiàn)[5]等應(yīng)用Dot-ELISA法對(duì)85份豬胴體進(jìn)行了沙門(mén)氏菌的檢測(cè)，結(jié)果表明，在85份肉樣中，Dot-ELISA檢出沙門(mén)氏菌陽(yáng)性65份，陽(yáng)性率為76.47%，檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)方法一致?？得鱗6]等應(yīng)用Dot-ELISA檢測(cè)魚(yú)粉85份，結(jié)果表明，64份為陽(yáng)性，常規(guī)分離培養(yǎng)法53份為陽(yáng)性，2種方法差異不顯著。由此可見(jiàn)，該方法簡(jiǎn)便、特異、快速、結(jié)果直觀，便于在基層推廣使用。

由于食品檢測(cè)樣品常為固液多相混合體，采用常規(guī)方法難以將少量致病微生物分離出來(lái)。借助免疫磁性分離技術(shù)，可以很快地在含有大量雜菌的懸液中有選擇性地分離出目的微生物，節(jié)省時(shí)間。目前，應(yīng)用該法分離檢驗(yàn)食品中的致病菌也有一些相關(guān)報(bào)道。Skjerve等報(bào)道了用免疫磁性分離技術(shù)從乳及乳制品、肉類(lèi)和蔬菜中分離出沙門(mén)氏菌，其檢測(cè)限為每克100個(gè)細(xì)菌。Mansfield等通過(guò)比較免疫磁性分離技術(shù)和常規(guī)方法從食品中分離沙門(mén)氏菌，他們用120種食物樣品，其中一半樣品中加入低濃度的沙門(mén)氏菌[7]。結(jié)果證實(shí)，就選擇性而言，抗沙門(mén)氏菌磁珠和增菌方法中最有效的亞硒酸鹽選擇性培養(yǎng)基一樣有效。值得強(qiáng)調(diào)的是，免疫磁性分離技術(shù)能捕獲受損傷的靶細(xì)菌，而目前所用的幾種常規(guī)方法則不具備這樣的能力。

全自動(dòng)熒光酶標(biāo)免疫分析儀對(duì)沙門(mén)氏菌的檢測(cè)鑒定結(jié)果比較成熟，并已先后被美國(guó)FDA、AOAC、USDA等部門(mén)認(rèn)可，我國(guó)學(xué)者也有相關(guān)研究報(bào)道?？苓\(yùn)同等利用自動(dòng)熒光酶標(biāo)分析系統(tǒng)快速檢測(cè)出口動(dòng)物性食品中沙門(mén)氏菌，結(jié)果表明，其靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，大大縮短檢驗(yàn)周期，可用于檢驗(yàn)出口動(dòng)物性食品中沙門(mén)氏菌。陶軍[8]等利用法國(guó)生物-梅里埃公司提供的“自動(dòng)酶標(biāo)免疫檢測(cè)儀”與常規(guī)培養(yǎng)法對(duì)凍肉中沙門(mén)氏菌進(jìn)行檢測(cè)，指出該儀器最大特點(diǎn)是對(duì)被檢細(xì)菌不需要純培養(yǎng)，只需在增菌培養(yǎng)基中即可檢出。黃玲[9]等利用自動(dòng)酶標(biāo)免疫測(cè)試儀和國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌，結(jié)果表明，該法具有靈敏度高、無(wú)傳染危險(xiǎn)、檢測(cè)速度快等特點(diǎn)。陳煒[10]等運(yùn)用自動(dòng)熒光酶標(biāo)分析儀和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法分別對(duì)同一種脫水蔬菜樣品中沙門(mén)氏菌進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，表明運(yùn)用自動(dòng)熒光酶標(biāo)分析儀檢測(cè)脫水蔬菜中的沙門(mén)氏菌靈敏度高、速度快，完全滿(mǎn)足檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)快速檢測(cè)的需要。

Munron應(yīng)用自動(dòng)熒光抗體檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)食品中的沙門(mén)氏菌，每小時(shí)能檢測(cè)到120個(gè)玻片樣品，與常規(guī)試驗(yàn)比較，準(zhǔn)確率達(dá)96%。Kyrinr和heimarch用熒光抗體檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)食品中的沙門(mén)氏菌，該系統(tǒng)可同時(shí)檢測(cè)14個(gè)樣品，并且結(jié)果可靠，操作簡(jiǎn)單。Cloak等利用表面吸附將檢測(cè)樣品吸附于玻璃表面的一種薄膜上，然后用免疫熒光顯微鏡進(jìn)行結(jié)果判定。該方法檢測(cè)限為103～105cfu/mL，且不呈現(xiàn)假陰性與假陽(yáng)性反應(yīng)。

英國(guó)Matrix公司是一家專(zhuān)業(yè)從事致病菌快速檢測(cè)系統(tǒng)研究、開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)的專(zhuān)業(yè)公司，其采用的免疫磁分離（IMS）方法快速檢測(cè)致病菌系統(tǒng)，是目前世界上速度最快的致病菌檢測(cè)方法之一。該方法已經(jīng)獲得美國(guó)AOAC認(rèn)證，具有高靈敏度、高特異性、高穩(wěn)定性、無(wú)污染、無(wú)毒性、檢測(cè)迅速等特點(diǎn)。它采用一種合成磁性材料—微磁珠，磁珠表面進(jìn)行基團(tuán)修飾并鍵合連接臂，將多克隆抗體或單克隆抗體連接后進(jìn)行包被，制成帶磁性的免疫抗體。磁性抗體可以選擇性吸附流動(dòng)樣品中的目標(biāo)抗原，借助外磁場(chǎng)的作用吸附在捕獲區(qū)，實(shí)現(xiàn)對(duì)大容量樣品中微生物的快速免疫濃縮純化。

在抗原富集問(wèn)題上，也有利用單克隆抗體標(biāo)記磁珠方法，直接將樣品與標(biāo)記磁珠混合，再進(jìn)行下一步ELISA檢測(cè)。MaxSignalTM沙門(mén)氏菌酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒為國(guó)家管理部門(mén)、食品生產(chǎn)商、質(zhì)檢部門(mén)提供了方便有效的方法，檢測(cè)水平為 105cfu/mL。

2.2 以核酸為基礎(chǔ)的方法

2.2.1 核酸雜交

細(xì)胞核酸DNA和RNA是一類(lèi)可以攜帶生物信息的大分子。由于所有的細(xì)胞都含有這類(lèi)分子，可以利用它作為檢測(cè)的標(biāo)靶。標(biāo)靶通常是一個(gè)特異性核酸序列，能夠結(jié)合核酸分子作為探針。與免疫學(xué)方法相似，探針也需要附加適當(dāng)?shù)臉?biāo)記，如放射性同位素、酶或發(fā)光的標(biāo)記物。Fitts等人1983年在食品沙門(mén)氏菌檢測(cè)中引入了第1代DNA-RNA雜交技術(shù)，此法應(yīng)用的探針含有用放射性同位素標(biāo)記的傷寒沙門(mén)氏菌DNA片段，其敏感性高，經(jīng)大約48 h的增菌步驟后，檢測(cè)極限可達(dá)108cfu/mL，但由于要使用放射性同位素，只能在專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。為此，發(fā)展了以核酸雜交為基礎(chǔ)的第2代技術(shù)——比色計(jì)。這種方法依賴(lài)于沙門(mén)氏菌核糖體RNA（rRNA）-核糖體發(fā)育過(guò)程中儲(chǔ)存的核酸成分的檢測(cè)[11]。核糖體是細(xì)胞蛋白質(zhì)合成器的一部分，每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中存在 5 000 ～ 20 000 個(gè)復(fù)制體，而相比之下染色體DNA復(fù)制體僅為2～10個(gè)。這種天然富含rRNA標(biāo)靶序列的情況使得用其他方法檢測(cè)成為可能，同時(shí)又保持了與放射性同位素方法相當(dāng)或更高的敏感性。其另一優(yōu)點(diǎn)是由于rRNA為單鏈（而DNA為雙鏈），雜交前無(wú)需經(jīng)過(guò)變性步驟。要得到陽(yáng)性結(jié)果，此法需要105cfu/mL，因此對(duì)沙門(mén)氏菌檢測(cè)來(lái)說(shuō)，需要進(jìn)行預(yù)增菌和選擇性增菌，總共約50 h。rRNA探針?lè)ū壬抽T(mén)氏菌ELISA法（酶聯(lián)免疫檢測(cè)法）更耗時(shí)，但二者成本相近。食品細(xì)菌檢測(cè)法的最新進(jìn)展是在化學(xué)擴(kuò)增體系方面，即聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），用該體系可對(duì)制備好的樣品進(jìn)行細(xì)菌DNA擴(kuò)增，以便更易于用諸如凝膠電泳法或比色型ELISA法檢測(cè)。用于檢測(cè)沙門(mén)氏菌和其他以食物為載體的病原的PCR方法也已建立，其中一些方法顯示了極好的敏感性。但該法較難自動(dòng)化，且必需經(jīng)選擇性增菌以稀釋可能干擾檢測(cè)反應(yīng)的某些成分。一個(gè)完整的以PCR為基礎(chǔ)的方法，需要2 d才能完成，很大程度上抵消了其高敏感性的優(yōu)點(diǎn)，但這種方法對(duì)那些含沙門(mén)氏菌較少或沙門(mén)氏菌“致傷”嚴(yán)重難以復(fù)蘇而仍保有沙門(mén)氏菌rRNA的樣品尤其有效。

2.2.2 PCR 法

Rahn等首先設(shè)計(jì)出一對(duì)引物，用PCR檢測(cè)沙門(mén)氏菌，檢出率為97%，但許多腸道桿菌能同時(shí)擴(kuò)增出來(lái)，特異性較差。此后，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者進(jìn)行了利用PCR技術(shù)檢測(cè)沙門(mén)氏菌的研究。Nguyen等根據(jù)腸炎沙門(mén)氏菌C7克隆株具有的屬特異性序列設(shè)計(jì)出一對(duì)引物，能快速地檢出肉食品標(biāo)本中的沙門(mén)氏菌，檢測(cè)的敏感性和特異性均為100%，保證了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。此外，我國(guó)盧強(qiáng)[12]等將自己建立的PCR擴(kuò)增invA基因特異性檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法用于食品樣品中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)，并結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶直接標(biāo)記基因探針技術(shù)和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)（ECL）技術(shù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Slot-blot雜交，新建立了PCR-ECL沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法，檢測(cè)限可達(dá)10 cfu/g，是一種有前途的快速檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌的方法。章新生[13]等根據(jù)寡核苷酸序列合成一對(duì)引物用于沙門(mén)氏菌的檢測(cè)，并對(duì)其特異性和擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了驗(yàn)證。黃金林[14]等根據(jù)沙門(mén)氏菌組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子基因序列設(shè)計(jì)引物序列，成功擴(kuò)增出495 bp沙門(mén)氏菌特異條帶，而陰性對(duì)照則無(wú)此條帶，從而建立了應(yīng)用PCR進(jìn)行沙門(mén)氏菌快速檢測(cè)的方法。應(yīng)用該方法對(duì)沙門(mén)氏菌屬A-F各群中共15株沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、27株沙門(mén)氏菌現(xiàn)場(chǎng)分離菌株和其他10株非沙門(mén)氏菌菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果沙門(mén)氏菌均顯示出495 bp特異性DNA擴(kuò)增條帶，而所有對(duì)照均不出現(xiàn)特異條帶，因此，此方法具有很強(qiáng)的沙門(mén)氏菌屬特異性。PCR敏感性試驗(yàn)顯示，該體系能檢出14 pg以上的沙門(mén)氏菌DNA。汪琦等[15]利用PCR方法快速檢測(cè)食品中的沙門(mén)氏菌。以全脂奶粉、生牛肉和加工過(guò)的雞肉為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，人為添加沙門(mén)氏菌，檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果一致。檢出限為 100 cfu/25 g，準(zhǔn)確性達(dá) 100%。

2.2.3 基因芯片技術(shù)

Chizhikov等采用寡核苷酸芯片研究沙門(mén)氏菌抗原和毒力因子與其致病性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌毒力因子可用于腸道致病菌的分析檢測(cè)。靳連群等利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)腸道中沙門(mén)氏菌等致病菌。結(jié)果顯示制備的基因芯片能夠檢測(cè)出致病菌，對(duì)于未知菌落利用基因芯片能夠在3 h完成對(duì)未知菌屬的鑒定。

2.2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP） 是一種在等溫條件下高特異、高效、快速地?cái)U(kuò)增靶序列的DNA擴(kuò)增新技術(shù)。以沙門(mén)氏菌為研究對(duì)象，根據(jù)其特異性的invA基因，設(shè)計(jì)了一套特異性引物對(duì)該基因進(jìn)行了LAMP，同時(shí)優(yōu)化了其反應(yīng)條件，建立了沙門(mén)氏菌的LAMP快速檢測(cè)技術(shù)。結(jié)果表明，LAMP的最佳反應(yīng)條件為外引物濃度5 pmol/L、內(nèi)引物濃 度 40 pmol/L，Mg2+濃 度 6 mmol/L，dNTP 濃度 0.8 mmol/L，甜菜堿濃度0.8 mmol/L，Bst DNA 聚合酶 8U，反應(yīng)溫度63 ℃，反應(yīng)時(shí)間1 h。在此條件下，LAMP檢測(cè)沙門(mén)氏菌DNA的敏感度達(dá)10 fg，且與其他常見(jiàn)的細(xì)菌無(wú)交叉反應(yīng)。其對(duì)牛奶樣品的檢出量為102cfu/mL，適合于食品中污染沙門(mén)氏菌的快速檢測(cè)[16-17]。

圖1 Real-time?PCR?有很好的重復(fù)性

圖2 Real-time?PCR 特異性及濃度梯度

圖3 Real-time?PCR 所制的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.5 實(shí)時(shí)定量 PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Realtime PCR） 技 術(shù) 于 1996 年 由 美 國(guó)Applied Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5′-3′外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的首選技術(shù)平臺(tái)?，F(xiàn)在作為檢測(cè)的基因有invA、stn、tyv、prt、viaB、flic-d/ flic-a、bipA 和 fimA。理論上只要有1個(gè)沙門(mén)氏菌就能檢測(cè)出，但在實(shí)踐中，一般能檢測(cè)出5個(gè)沙門(mén)氏菌[18]。

磁珠富集與實(shí)時(shí)定量PCR，利用抗體標(biāo)記的磁珠對(duì)沙門(mén)氏菌富集，進(jìn)一步提高靈敏度。

3 其他檢測(cè)方法

3.1 電阻抗法

阻抗法是幾種方法中最少受到主觀因素干擾的方法。我國(guó)陳廣全等[19]用電阻抗法檢測(cè)食品中的沙門(mén)氏菌。經(jīng)與常規(guī)培養(yǎng)法進(jìn)行比較，對(duì)加入食品中的21種已知沙門(mén)氏菌屬檢測(cè)，電阻抗法19個(gè)為陽(yáng)性，檢出率在90%以上，檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)培養(yǎng)法一致，對(duì)于陰性結(jié)果能在48 h內(nèi)得出。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明電阻抗法能夠快速、可靠地檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌。

3.2 沙門(mén)氏菌毒素快速檢驗(yàn)法

本法是根據(jù)沙門(mén)氏菌等腸科桿菌具有產(chǎn)生內(nèi)毒素的特點(diǎn)，采用氧化呈色反應(yīng)進(jìn)行的快速檢驗(yàn)。在被檢肉浸液中，若含內(nèi)毒素，加入的硝酸銀使毒素氧化成氧化型毒素，氧化型毒素和加入肉浸液中的美藍(lán)牢固結(jié)合，當(dāng)再向肉浸液中加入高錳酸鉀時(shí)，美藍(lán)不與高錳酸鉀作用，使肉浸液呈藍(lán)綠色。

3.3 4-甲基傘形酮辛酯檢測(cè)法

4-甲基傘形酮辛酯（MUCAP）檢測(cè)法是利用沙門(mén)氏菌具有其他各屬細(xì)菌都不具備的產(chǎn)生辛酯酶的特性，選用相應(yīng)的底物和指示劑，將其配制在相關(guān)的培養(yǎng)基中，根據(jù)沙門(mén)氏菌反應(yīng)后出現(xiàn)的明顯顏色變化，而確定待檢可疑菌株[20]。

3.4 葡萄球菌A蛋白協(xié)凝試驗(yàn)法

Staphylococcal Protein A 簡(jiǎn)稱(chēng) SPA即葡萄球菌A蛋白。目前，國(guó)外已將SPA用于沙門(mén)氏菌的快速檢驗(yàn)，所用的葡萄球菌菌株多為CowanⅠ株。國(guó)內(nèi)應(yīng)用該法檢驗(yàn)食品中沙門(mén)氏菌報(bào)道很少，曹同雪等采用SPA協(xié)凝試驗(yàn)法檢測(cè)100個(gè)肉樣中的沙門(mén)氏菌，結(jié)果表明該法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、檢出率高并且節(jié)省費(fèi)用[21]。

3.5 生物傳感器

使用集成化手持式SpreetaTM SPR傳感器快速檢測(cè)沙門(mén)氏菌，利用親和素-生物素系統(tǒng)保證了檢測(cè)的準(zhǔn)確性；同時(shí)利用沙門(mén)氏菌抗體的免疫吸附反應(yīng)，保證了結(jié)果的特異性；并引入復(fù)合抗體作為第二抗體以擴(kuò)大檢測(cè)的響應(yīng)信號(hào)，檢測(cè)到鼠傷寒沙門(mén)氏菌的濃度為105cfu/mL，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程在1 h內(nèi)完成，從一定程度上實(shí)現(xiàn)了食品中病原微生物的快速檢測(cè)[22]。

沙門(mén)氏菌作為食品衛(wèi)生檢驗(yàn)一項(xiàng)重要目標(biāo)菌，其檢測(cè)方法的研究有著重要意義。提高沙門(mén)氏菌檢測(cè)靈敏度，縮短檢測(cè)時(shí)間、簡(jiǎn)化檢測(cè)程序，使沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法向自動(dòng)化、快速化、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、簡(jiǎn)易、經(jīng)濟(jì)等方向不斷發(fā)展。隨著社會(huì)發(fā)展與科技進(jìn)步，新的微生物檢驗(yàn)方法和手段不斷涌現(xiàn)，這些檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)檢測(cè)方法大體一致，能夠快速、可靠的檢測(cè)出食品中的沙門(mén)氏菌。

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