朱雨 鄒晏 江舟 汪宇輝 劉延友 王正榮

(四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究室,四川成都 610041)

生物體普遍存在調(diào)控生命活動(dòng)約為24 h的近日節(jié)律[1]。mPer1為近日節(jié)律振蕩器的核心組件,mPer1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的磷酸化和入核在近日節(jié)律的產(chǎn)生和調(diào)控中起重要作用。Period1(PER1)是近日節(jié)律系統(tǒng)中的核心蛋白,并且與機(jī)體其他功能諸如藥物依賴、腫瘤發(fā)生等[2-3]密切相關(guān)。Gnb2l1是一個(gè)看家基因,在細(xì)胞接受刺激的時(shí)候,Gnb2l1基因能夠迅速作出反應(yīng),編碼合成RACK1蛋白,實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控,并進(jìn)一步引發(fā)一系列遲發(fā)反應(yīng)。前期研究表明RACK1蛋白為PER1相互作用的節(jié)律相關(guān)蛋白,上調(diào)及下調(diào)PER1基因并未影響RACK1的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)[4]。因此推測RACK1并非PER1的下游鐘控蛋白,RACK1可能通過參與/介導(dǎo)PER1相關(guān)的信號(hào)分子通路,進(jìn)而影響PER1節(jié)律及其他功能的實(shí)現(xiàn)。因此本文研究過表達(dá)Gnb2l1發(fā)現(xiàn)mPer1表達(dá)量明顯增高,可以推測Gnb2l1可能是mPer1的上游鐘控基因。進(jìn)一步揭示生物節(jié)律信號(hào)通路的分子機(jī)制、研究 RACK1與PER1的功能聯(lián)系提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 NIH3T3細(xì)胞由華西醫(yī)學(xué)中心微生物教研室饋贈(zèng)。

1.2 試劑 DMEM 培養(yǎng)基(Hyclone),小牛血清(Hyclone),青霉素(華北制藥廠),鏈霉素(華北制藥廠),胰蛋白酶(寶信生物公司),PMA(phorboll 2-myristate 13-acetate,Promega),Trizol(Invitrogen),RT-PCR一步法試劑盒(Takara),TaqDNA polymerase(Tiangen),Lipofectamine 2000(Invitrogen),質(zhì)粒抽提試劑盒(GIAGENE)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo) 細(xì)胞于含10%小牛血清、100U?ml-1青霉素及100 U?ml-1鏈霉素的DM EM 培養(yǎng)基中,5%CO2孵箱內(nèi)37℃靜置培養(yǎng)。NIH3T3細(xì)胞按每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于十二孔板,待細(xì)胞 12h貼壁后,更換新鮮培養(yǎng)基(每孔1.98ml),每孔加PMA 20μ l,終濃度為100 nm?L-1。

1.4 轉(zhuǎn)染 PMA刺激24h后,按照脂質(zhì)體LipofectamineTX2000說明書,將 pCDNA3.1/Gnb2l1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞(A組),以pCDNA3.1/vector質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對(duì)照(B組)。轉(zhuǎn)染12h后,每隔2h分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞各3孔,共收集48h,24個(gè)時(shí)間點(diǎn)。

1.5 RT-PCR檢測Gnb2l1,mPer1的表達(dá) T rizol法提取細(xì)胞總 RNA,采用半定量 RT-PCR法特異性擴(kuò)增 Gnb2l1和mPer1mRNA,分別與內(nèi)參積分光密度(OD)值相比來分析Gnb2l1和mPer1mRNA相對(duì)表達(dá)水平。引物由Invitrogen公司合成,序列見表1。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)效率的鑒定

RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。用Gel-Pro Analyzer軟件,分析 Gnb2l1及β-actin,經(jīng) RT-PCR所得條帶的(OD)值,計(jì)算Rtime=OD-Gnb2l1/OD-β-actin,如圖 2所示。圖中可以看出實(shí)驗(yàn)組的Gnb2l1表達(dá)量比對(duì)照組明顯增高(p＜0.05)。

表1 引物序列

圖1 PT-PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 Gnb211與β-actin mRNAs表達(dá)

2.2 RT-PCR測定過表達(dá)Gnb2l1基因?qū)?jié)律基因mPer1表達(dá)的影響

過表達(dá)Gnb2l1基因轉(zhuǎn)染后可導(dǎo)致節(jié)律基因mPer1表達(dá)顯著性增高(見圖3,圖4)。圖中可以看出ZT8,ZT11和ZT12的作用更顯著,其余的時(shí)間點(diǎn)普遍A組比B組高。2.3 余弦法分析mPer1的表達(dá)周期用余弦法分析,典型的結(jié)果如圖5。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組(A組)的mPer1表達(dá)中值比對(duì)照組(B組)明顯增高,但 mPer1表達(dá)的振幅和相位,A組與B組的并無明顯差別(p＞0.05)。

圖3 mPer1電泳圖

圖4 mPer1mRNAs表達(dá)

圖5 余法分析mPer1mRNA s節(jié)律表達(dá)

3 討論

Gnb2l1是一個(gè)看家基因,在正常細(xì)胞中它編碼合成RACK1蛋白。RACK1蛋白作為胞內(nèi)重要的骨架蛋白、接頭蛋白、錨定蛋白[5-11],參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子復(fù)合物生成、影響活性分子亞細(xì)胞定位、溝通不同信號(hào)通路之間的聯(lián)系,從而發(fā)揮其對(duì)于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)、細(xì)胞增殖分化等各方面的調(diào)節(jié)作用,因此研究者普遍認(rèn)為RACK1參與了生物體許多重要的生理過程。在神經(jīng)科學(xué)研究中,RACK1蛋白是一個(gè)非常重要而活躍的研究領(lǐng)域,神經(jīng)系統(tǒng)的 RACK1功能具有相當(dāng)?shù)膹?fù)雜性[12-15]。

mPer1在近日節(jié)律鐘控系統(tǒng)中處于核心地位。目前研究發(fā)現(xiàn)PER1主要通過PAS結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)蛋白間相互作用而發(fā)揮生理功能,但其確切機(jī)制尚不清楚。RACK1作為胞內(nèi)接頭蛋白,介導(dǎo)了PKC、PKA等信號(hào)通路及其之間的聯(lián)系,上述信號(hào)通路已證實(shí)在近日節(jié)律輸入輸出通路中發(fā)揮著重要作用。前期研究發(fā)現(xiàn),RACK1與PER1蛋白的細(xì)胞內(nèi)分布改變有關(guān),提示RACK1可能介導(dǎo)了PER1的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位、入核。RACK1與PER1的結(jié)合也可能并非意味著RACK1直接介導(dǎo)PER1功能,而提示 RACK1以橋接分子的形式和PER1結(jié)合,并通過將PER1與其他活性分子(諸如受體,蛋白激酶,細(xì)胞因子,轉(zhuǎn)錄因子等)相聯(lián)系而參與PER1相關(guān)功能實(shí)現(xiàn)(諸如PER1從胞漿轉(zhuǎn)位到核周以及PER1分子對(duì)于近日節(jié)律基因的轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控等)。

本實(shí)驗(yàn)通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因 Gnb2l1轉(zhuǎn)染入NIH3T3細(xì)胞,用RT-PCR技術(shù)檢測 Gnb2l1和 mPer1 mRNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示過表達(dá)Gnb2l1能夠誘導(dǎo)mPer1表達(dá)量的增加。余弦分析亦顯示過表達(dá)Gnb2l1導(dǎo)致mPer1表達(dá)的調(diào)整中值升高,提示Gnb2l1可能是mPer1的上游鐘控基因。

本研究進(jìn)一步完善近日節(jié)律的分子機(jī)制,而且對(duì)生物節(jié)律相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制乃至治療的研究提供新的思路和方向。但是Gnb2l1與mPer1的相互作用非常復(fù)雜,如要明確之間的作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

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