劉明巖 耿會珍 蔣獻 黃寧 王伯瑤 吳琦△

(1.四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院感染免疫研究室,四川 成都 610041;2.四川大學華西醫(yī)院皮膚科,四川 成都 610041)

天然免疫系統(tǒng)是機體抵御病原體入侵的第一道防線,它能夠在獲得性免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對性更強的特異應答之前,率先消除或減輕由病原體入侵所造成的后果。天然免疫通過物理、化學與生物學屏障,阻擋或消滅入侵的病原體,同時減輕組織損傷與細胞壞死,遏制病原體可能引起的病理生理學改變。上皮細胞是天然免疫的重要組成部分,最近的研究顯示,通過上皮細胞與細菌的直接接觸,或者上皮細胞吞噬攝取細菌,上皮細胞有很強的抗菌能力。

角質(zhì)形成細胞在皮膚免疫防御和炎癥反應中功能活躍,是皮膚復雜生化防御機制的細胞基礎,由角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生的抗菌效應分子形成了皮膚的抗菌屏障(Antimicrobial barrier)。金黃色葡萄球菌在醫(yī)學上占據(jù)重要地位,既可以引起局部感染,也可以造成全身系統(tǒng)性感染。在皮膚感染中金黃色葡萄球菌是最常見的致病菌,但正常皮膚有時也可以檢出金黃色葡萄球菌,因此研究角質(zhì)形成細胞與金黃色葡萄球菌的關(guān)系對認識皮膚抗感染防御機制及皮膚感染性疾病發(fā)病機理都有幫助。本文觀察了金黃色葡萄球菌在角質(zhì)形成細胞中的存活情況。

1 材料與方法

1.1 材料

金黃色葡萄球菌(ATCC)標準株25923本室保存,人角質(zhì)形成細胞株HaCaT為本室保存。RPMI-1640為GIBCO產(chǎn)品,新生牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司,TritonX-100,佛波酯(PMA)、Forskolin(FSK)購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng)

從LB平板中挑取單菌落接種于5ml LB液體培養(yǎng)基,150轉(zhuǎn)?min-1振蕩培養(yǎng)3～5h,取100ul菌液鋪于LB固體培養(yǎng)板,37℃孵箱培養(yǎng)16h后收集活菌,用PBS洗滌細菌三次,紫外分光光度計測定600nmOD值確定細菌濃度。

1.2.2 角質(zhì)形成細胞株HaCaT培養(yǎng)

HaCaT細胞用含10%新生牛血清的1640培養(yǎng)基(無抗生素),37℃5%CO2孵箱常規(guī)培養(yǎng)傳代。實驗時以1.2×105個細胞?孔-1接種于24孔板,待細胞融合時(≈2.5×105?孔-1)進行實驗。

1.2.3 金黃色葡萄球菌在細胞HaCaT內(nèi)存活的動態(tài)觀察

HaCaT細胞用PBS洗三次,加入用1640培養(yǎng)基稀釋好的細菌,每孔400μ l,細菌與細胞的比例為100∶1,置CO2孵箱孵育2h。用含有慶大霉素(100μ g?ml-1)的PBS洗細胞三次,每孔加入含有慶大霉素(100μ g?ml-1)及10%新生牛血清的1640培養(yǎng)基1000ul,37℃5%CO2孵箱孵育,以殺死胞外金黃色葡萄球菌。分別于實驗4、24、48及72h,用0.25%TritonX-100裂解細胞,釋放出細胞內(nèi)的活細菌,用平板菌落計數(shù)法計數(shù)胞內(nèi)活菌數(shù)。每實驗組為3復孔,每孔樣品涂2個細菌培養(yǎng)板。

1.2.4 PM A、FSK對 HaCaT細胞抗菌作用的影響

HaCaT細胞用PBS洗三次,加入用1640培養(yǎng)基稀釋好的細菌,每孔400μ l,細菌與細胞的比例為100∶1,置CO2孵箱孵育2h。用含有慶大霉素(100μ g?ml-1)的PBS洗細胞三次,每孔加入含有慶大霉素(100μ g?ml-1)、10%新生牛血清及 PM A(或FSK)的1640培養(yǎng)基1000ul,培養(yǎng)基中 PMA終濃度分別為0(對照)、1 μ M 、2 μ M 、5 μ M;培養(yǎng)基中 FSK 終濃度分別為 0(對照)、1μ M 、2 μ M 、5 μ M 。 置 37℃ 5%CO2孵箱孵 育。 在實 驗開始(加入細菌)后的24h,用 0.25%T ritonX-100裂解細胞,釋放出細胞內(nèi)的活細菌,平板菌落計數(shù)法計數(shù)胞內(nèi)活菌數(shù)。每個實驗組為3復孔。

1.3 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)以SPSS進行統(tǒng)計學處理,數(shù)值以表示。采用 t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 金黃色葡萄球菌在HaCaT細胞內(nèi)的動態(tài)變化

結(jié)果顯示,24h細菌數(shù)量比4h增加16.0%,48h細菌數(shù)量比4h減少74.5%,而72h胞內(nèi)細菌數(shù)量比4h減少了95.9%(圖1)。

圖1 金黃色葡萄球菌ATCC 25923株在HaCaT細胞內(nèi)存活的動態(tài)觀察

2.2 PMA對HaCaT細胞抗菌作用的影響

實驗發(fā)現(xiàn),1μM組細胞內(nèi)活菌數(shù)量與空白對照組相比減少14.52%。2μM組細胞內(nèi)活菌數(shù)量與空白對照組相比減少26.16%。5μM組細胞內(nèi)活菌數(shù)量與空白對照組相比減少46.05%(P＜0.05)。結(jié)果說明使用PMA可以促進皮膚角質(zhì)形成細胞殺滅胞內(nèi)金黃色葡萄球菌,并且PMA作用呈濃度依賴關(guān)系(圖2)。

圖2 PMA對金黃色葡萄球菌ATCC 25923株在HaCaT細胞內(nèi)存活的影響

2.3 FSK對HaCaT細胞抗菌作用的影響

實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),1 μ M組細胞內(nèi)活菌數(shù)量與空白對照組相比減少35.32%。2 μ M組細胞內(nèi)活菌數(shù)量與空白對照組相比減少41.28%。5 μ M組細胞內(nèi)活菌數(shù)量與空白對照組相比減少69.98%(P＜0.05)。實驗說明使用FSK可以促進皮膚角質(zhì)形成細胞清除胞內(nèi)菌,并呈濃度依賴關(guān)系(圖3)。

3 討論

人體的皮膚與粘膜有大量微生物寄居,正常情況下這些微生物與我們機體處于共生狀態(tài),而不發(fā)生感染致病,這主要應該歸功于和微生物直接接觸的上皮細胞的保護作用。上皮細胞與細菌之間的信息交流,上皮細胞怎樣有效控制細菌,不使它們過度生長或者造成感染,成為醫(yī)學研究的重要內(nèi)容[1]。

過去曾經(jīng)認為只有少數(shù)細菌(比如結(jié)核桿菌)能夠進入細胞,而大多數(shù)細菌則被認為引起細胞外感染。最近10多年醫(yī)學微生物學研究結(jié)果改變了這一觀點,許多細菌在感染致病過程中不但粘附于上皮細胞,它們還能夠進入細胞,這個現(xiàn)象被稱為侵襲(Invasion)。腸道致病菌如沙門氏菌、志賀氏菌、耶爾森氏菌,呼吸道致病菌如銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯桿菌,都能夠進入上皮細胞。細菌侵襲上皮細胞是宿主和微生物之間在長期生命進化過程中共同形成的一種生物學現(xiàn)象,這一現(xiàn)象是否促進細菌感染致病只能取決于雙方的情況,也即侵入的細菌是否足以對抗上皮細胞內(nèi)復雜而強大的天然免疫機制。

圖3 FSK對金黃色葡萄球菌ATCC 25923株在HaCaT細胞內(nèi)存活的影響

金黃色葡萄球菌不但在正常皮膚可以檢出,更是皮膚感染的重要致病菌,因此很有必要探討角質(zhì)形成細胞與金黃色葡萄球菌的關(guān)系。有關(guān)金黃色葡萄球菌侵襲的研究更多是站在細菌致病性的角度在探討這一現(xiàn)象,而較少涉及上皮細胞對外來微生物的免疫防御作用[2-4]。本研究在體外細胞模型觀察了金黃色葡萄球菌對HaCaT細胞的侵襲,HaCaT細胞是自發(fā)轉(zhuǎn)化的永生化皮膚角質(zhì)形成細胞而非腫瘤細胞,它在生物特性上與正常人角質(zhì)形成細胞很接近。實驗觀察到金黃色葡萄球菌進入細胞24h比4h有增加,表明這段時間細菌有生長,而48h細菌顯著下降,提示細胞產(chǎn)生了較強抗菌作用。為探討HaCaT細胞清除胞內(nèi)細菌的機制,實驗用蛋白激酶C激活劑(PMA)及腺苷酸環(huán)化酶激活劑(FSK)作用于細胞,結(jié)果觀察到這二種試劑都顯著增強了細胞的抗菌活性。PMA激活蛋白激酶C,后者可以激活NADPH氧化酶(NOX家族),另外有文獻報道FSK可以激活NOX家族的Duox-1[5],因此本實驗結(jié)果提示HaCaT細胞清除胞內(nèi)細菌可能與NOX分子產(chǎn)生的活性氧相關(guān)。最近已有報道顯示呼吸道上皮細胞產(chǎn)生活性氧可能是其防御機制[6-7],本研究提供了NADPH氧化酶與皮膚抗感染相關(guān)的線索,值得作深入研究。

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