周新娥 歐陽運薇 潘小玲△ 何躍東 李恒 鄧璐霞 黃寧 吳琦

(1.成都市婦產(chǎn)科醫(yī)院婦產(chǎn)科,成都 610015;2.四川大學華西第二醫(yī)院婦產(chǎn)科,成都 610041;3.四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院感染免疫教研室,成都 610041)

女性生殖道感染是婦產(chǎn)科的常見病、多發(fā)病,各年齡組均可發(fā)病。大腸埃希菌既是女性陰道正常菌群之一,又是引起女性生殖道感染常見革蘭陰性菌之一,比如,在近25%的細菌性陰道病患者中可以分離到大腸埃希菌。

血紅蛋白除了最基本的攜氧功能外,新近發(fā)現(xiàn)血紅蛋白及其片段還具有抗菌的生物學活性[1-3]。迄今,血紅蛋白及其片段的抗菌活性研究均見于體外實驗,而無整體動物實驗報道。因此我們建立大鼠大腸埃希菌陰道感染模型,通過陰道局部給予血紅蛋白,探討血紅蛋白在體內(nèi)是否具有抗菌抑炎作用,從而為將來直接應用或者間接通過基因工程生產(chǎn)血紅蛋白片段重組產(chǎn)品用于臨床包括女性生殖道感染在內(nèi)的防治提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 一氧化碳購自四川天一科技股份有限公司。

1.1.2 實驗動物 雌性Wistar大鼠,性成熟未交配,體重180.2±5.8g,由四川大學華西醫(yī)學中心實驗動物中心提供。

1.1.3 病原體 大腸埃希菌臨床分離株來自四川抗生素研究所饋贈。

1.2 實驗方法

1.2.1 裂解紅細胞、分離提純出血紅蛋白 取志愿者數(shù)毫升血液肝素抗凝,通入一氧化碳氣體180s并輕搖,生理鹽水洗三次,離心除上清,加入0.2倍體積二氯甲烷漩渦振蕩3min后離心取最上層,再重復加入二氯甲烷處理。避光60℃加熱1h,離心取上清,即為血紅蛋白。

1.2.2 建立大鼠陰道感染模型 無菌條件下切除大鼠雙側(cè)卵巢,皮下注射苯甲酸雌二醇建立和維持假動情期,皮下注射氫化可的松琥珀酸鈉造成全身免疫力低下,生理鹽水反復沖洗陰道后,陰道內(nèi)注入大腸埃希菌(2.1×109CFU?ml-1),每日接種一次,共接種三次。每日觀察大鼠外觀和陰道外口分泌物、局部有無紅腫等炎性表現(xiàn)。造模動物隔日交替皮下注射苯甲酸雌二醇或氫化可的松琥珀酸鈉,以維持動情期和免疫功能低下狀態(tài)。感染5d后肉眼和病理組織學檢查陰道粘膜充血、水腫或炎細胞浸潤等者為感染成功。

1.2.3 實驗動物的分組及處理 將感染成功的大鼠隨機分組：基質(zhì)對照組(感染后不治療,n=7),血紅蛋白治療組(實驗組,n=9),每只每天陰道給血紅蛋白5mg,連續(xù)5d。另設模型對照組(n=5),正常對照組(n=2)。

1.2.4 病理觀察 末次給藥后24h將大鼠處死取子宮宮頸陰道標本,先進行肉眼觀察、稱重。計算臟器指數(shù)：子宮宮頸陰道重量(g)/體重(g)然后進行常規(guī)石蠟切片,HE染色,鏡下觀察陰道組織形態(tài)學變化及粘膜、粘膜下間質(zhì)形態(tài)學的炎癥改變程度,根據(jù)評定標準評定炎癥程度。

圖1 大鼠陰道分泌物涂片(200×)

1.3 統(tǒng)計學處理 采用統(tǒng)計軟件spss13.0,單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 實驗大鼠動情周期的監(jiān)測

大鼠去卵巢后的陰道分泌物涂片鏡下觀如圖1A,鏡下見大部分是白細胞,偶爾可見有核扁平上皮細胞。給予苯甲酸雌二醇后的陰道分泌物涂片鏡下觀如圖1B,鏡下見膨大的上皮細胞核消失,脫落的角化上皮細胞并聚,似落葉堆疊。如去卵巢后大鼠的陰道涂片不似圖1A,說明該只大鼠的卵巢未切除完全,剔除該只大鼠;如給予苯甲酸雌二醇皮下注射后的陰道分泌物不似圖1B,進一步說明該只大鼠的卵巢未切除干凈存在內(nèi)源性雌激素,也剔除該只大鼠。

2.2 大鼠的子宮宮頸陰道臟器指數(shù)的影響

血紅蛋白組、模型對照組間無差異(P＞0.05),基質(zhì)對照組與前兩組比有顯著性差異(P＜0.05),血紅蛋白組的臟器指數(shù)較基質(zhì)對照組的減少明顯,提示血紅蛋白能減輕感染后的局部水腫等炎癥程度,見表1。

2.3 大鼠陰道組織形態(tài)學觀察

從圖2可見,模型對照組大鼠復層扁平上皮較正常大鼠稍厚,表層平滑完整,固有層全層較疏松,余未見異常;基質(zhì)對照組大鼠復層扁平上皮表層不平滑,固有層內(nèi)有大量的炎細胞浸潤伴血管擴張充血;與基質(zhì)對照組相比,血紅蛋白組大鼠陰道復層扁平上皮表層較平滑,固有層內(nèi)炎細胞浸潤明顯減少,且組織內(nèi)充血明顯減輕。復層扁平上皮的增厚可能與外源性雌激素的作用有關,因為雌激素可導致陰道復層扁平上皮增生和角化,粘膜增厚。

表1 血紅蛋白對大鼠子宮宮頸陰道臟器指數(shù)的影響()

表1 血紅蛋白對大鼠子宮宮頸陰道臟器指數(shù)的影響()

組 別 動物數(shù)(只)子宮宮頸陰道臟器指數(shù)(g?g-1)模型對照組 5 3.52×10-3±3.63×10-4基質(zhì)對照組 7 5.38×10-3±7.44×10-4血紅蛋白組 9 3.88×10-3±4.56×10-4

3 討論

女性生殖道感染是婦科常見疾病,各年齡組均可發(fā)病,育齡婦女是生殖道感染的主要易患人群,可造成流產(chǎn)、早產(chǎn)、低出生體重兒、異位妊娠、盆腔炎癥、宮頸癌、焦慮等,嚴重影響育齡婦女的生殖健康和身心健康。因而,生殖道感染是目前國內(nèi)比較關注的生殖健康問題。

圖2 各組大鼠陰道病理變化(HE)

目前有關細菌性陰道感染動物模型的報道,采用的方式一為去除卵巢后給外源性雌激素,反復陰道沖洗后再以細菌攻擊。另一方式直接用細菌攻擊。前者的優(yōu)點在于先去除卵巢消除了內(nèi)源性雌激素對大鼠動情周期的影響,再給予外源性雌激素使動物同步維持在動情周期的動情期階段,有文獻報道動情期動物更易于細菌的陰道定植[4];加用糖皮質(zhì)激素,使造模動物全身免疫功能低下;而陰道沖洗可改變陰道pH值,陰道環(huán)境改變,更有利于大腸埃希菌等病原體在陰道粘膜的定植[5]。直接用細菌攻擊建造模型的方法,雖然步驟簡單,實驗周期短,但是由于動物可能處于動情周期的不同階段,或由于其保持原有免疫功能從而可能影響感染動物之間的同步性。所以本實驗選擇了第一種方式來建立動物模型,通過陰道分泌物涂片白細胞及脫落上皮細胞的變化來監(jiān)測模型動物去卵巢和外源性雌激素的效果。在給予大腸埃希菌攻擊后,大鼠陰道外口變化及陰道病理切片均證實了模型建立成功。

迄今治療陰道炎的主要手段是采用抗菌類的化學合成藥物,其治療方式多為陰道沖洗、口服或陰道局部給藥。然而采用這些治療可能帶來菌群失調(diào)的后果,表現(xiàn)為正常乳酸桿菌明顯減少,而腸桿菌、球菌卻異常增多。而且化學合成藥物雖短期療效好,但由于其有致畸可能等原因多慎用于孕婦、特別是停藥后易復發(fā),同時也極易誘發(fā)細菌產(chǎn)生耐藥性成為其弱點。所以開發(fā)應用新型天然藥物以治療陰道炎是基礎與臨床應用重要的研究方向之一。比如新近應用乳酸桿菌等生物活性劑,通過調(diào)節(jié)陰道內(nèi)正常菌群,起到抑制致病菌生長的作用。

血紅蛋白在體外具有強的抗大腸埃希菌作用,是一種內(nèi)源性的抗菌肽分子,由于內(nèi)源性抗菌肽分子具有較低幾率產(chǎn)生耐藥性的特點,所以學術界認為它有可能是新抗微生物戰(zhàn)略中的重要后選分子之一。各組陰道組織病理切片HE染色鏡下觀,證實血紅蛋白處理后陰道炎細胞侵潤數(shù)較基質(zhì)對照組減少,血管擴張減輕消失。同時血紅蛋白組大鼠的子宮宮頸臟器指數(shù)較基質(zhì)對照組降低,也提示血紅蛋白能減輕大鼠大腸埃希菌性陰道感染的炎癥反應程度。

文獻報道血紅蛋白及其片段有直接的抗大腸埃希菌作用,雖本實驗在動物體內(nèi)直接使用的是血紅蛋白,但血紅蛋白在生物學活體內(nèi)可受酶解成血紅蛋白片段。Inavon[6]認為血紅蛋白在紅細胞內(nèi)自然分解生成一些較大的片段,然后分泌出紅細胞,在細胞外不同組織進一步分解成為較小的血紅蛋白片段,形成所謂的“血紅蛋白肽庫”,以發(fā)揮它們的不同生物學效應。Mak[2]認為血紅蛋白在陰道受氨基肽酶或羧基肽酶的影響可降解為血紅蛋白片段發(fā)揮抗菌作用。因此本實驗雖直接使用的是血紅蛋白,在動物感染炎癥模型中,它也可能在白細胞等釋放的蛋白酶作用下,降解為不同分子的片段起到抗菌抑炎的作用。

1 Liepke C,Baxmann S,Heine C,et al.Human hemoglobin-derived peptides exhibit antimicrobial activity：a class of host defense peptides[J].Journal of Chromatography B,2003,791(1-2)：345-356.

2 Mak P,Wicherek L,Suder P,et al.Analy sis of free hemoglobin level and hemog lobin peptides from human puerperal uterine secretions[J].J Soc Gynecologic Investig,2006,13(4)：285-291.

3 王莉莉,潘小玲,馬懿,等.子宮內(nèi)膜黏液抗菌肽的分離純化及鑒定[J].中華醫(yī)學雜志,2006,86(29)：2044-2048.

4 劉文.大鼠陰道炎模型的建立及婦炎消洗劑治療作用的研究[J].貴陽中醫(yī)學院學報,1996,18(4)：59-60.

5 石一復.盆腔炎的誘發(fā)因素[J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志,1998,14(6)：323-324.

6 Ivanov V T,Karelin AA,Philippova MM.Hemoglobin as a sourse of endogenous bioactive peptides：the concept of tissue-specific peptide pool[J].Biopolymers,1997,43(2)：171-178.