程俊 曾曉榮 李鵬云 李妙齡 劉智飛 裴杰 楊艷

(四川省瀘州醫(yī)學(xué)院心肌電生理學(xué)研究室,四川 瀘州 646000)

單個細胞的獲取已經(jīng)廣泛應(yīng)用到科研工作的各個領(lǐng)域中,成為科研工作中不可或缺的對象,獲取單個動脈平滑肌細胞常用的方法有貼塊法和急性酶分離法。急性酶分離法由于酶的作用使細胞間失去連接,細胞內(nèi)肌絲含量豐富,保持收縮型狀態(tài),適用于單細胞的研究,常應(yīng)用到膜片鉗技術(shù)、共聚焦顯微技術(shù)、胞內(nèi)物質(zhì)的測定、流式細胞儀技術(shù)等研究領(lǐng)域。這些研究對單個細胞的要求都非常高,需要細胞獲取率高、活性好、膜光滑、膜的折光性好。而影響急性酶分離法的關(guān)鍵因素在于控制酶的濃度、消化時間、消化溫度等。那怎么樣才能獲取單個的高質(zhì)量的動脈平滑肌細胞呢?現(xiàn)就筆者從事多年的動脈平滑肌細胞的研究工作的經(jīng)驗,以單個人體腸系膜動脈平滑肌細胞應(yīng)用于膜片鉗技術(shù)中為例,介紹幾種實用的急性酶分離動脈平滑肌細胞的方法,以供大家參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 配置溶液

臺式液(mmol? L-1)：NaC1127、KC15.9、MgC121.2、CaC122.4、Glucose 12、HEPES 10,pH 7.4(with NaOH)。無鈣臺式液除不含CaC12外,其余成分與臺式液一致[1];單通道膜片鉗電極內(nèi)液(mmol? L-1)：KC1100、K-Asp 40、HEPES 10、EGTA 2,pH 7.2-7.4(with KOH);單通道膜片鉗浴液(mmol? L-1)：KCl 40、K-Asp 100、HEPES 10、EGTA 2,pH 7.4(with KOH);穿孔膜片鉗電極內(nèi)液組成(mmol?L-1)[4]：KCl 140,M gCl24.0,HEPES 10,EGTA 0.05,pH=7.2(with KOH),其中 Amphotericin-B 為200μ g?ml-1[2];全細胞膜片鉗浴液組成(mmol?L-1)[5]：NaCl 137,KCl 5.9,MgCl21.2,CaCl21.8,HEPES 10,Glucose 14,pH=7.4(with NaOH)[3]。

1.1.2 標(biāo)本來源

標(biāo)本取自于瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腹部手術(shù)病人切除物中腸系膜動脈細小分支,取下腸系膜組織,立即放于臺氏液中,用冰塊保存迅速返回實驗室,游離出小動脈,剔除表面的結(jié)締組織和外膜,在體式顯微鏡下縱向剖開,剪成2-3 mm的小塊備用。

1.1.3 酶液的組成

H型膠原酶法酶液組成(mg?ml-1)：酶Ⅰ：Papain 1.25,DTT 2.0,Alb 2.0;酶 Ⅱ ：H 型Collagenase 1.25,Hyaluronidase 1.5,Alb 2.0[4]。

F型膠原酶法酶液的組成(mg?ml-1)：酶Ⅰ：Papain 1,DTT 0.68,Alb 2.0;酶 Ⅱ ：F 型 Collagenase 1.615。

Ⅺ型膠原酶法酶液的組成(mg?ml-1)：酶Ⅰ：P 1.3,DTT 0.15,Alb 1.7;酶Ⅱ：Ⅺ型Collagenase 1.3,Hyaluronidase 1.1,Alb 1.7。

1.2 方法

1.2.1 分離血管平滑肌細胞

1.2.1.1 H型膠原酶法

在20-25℃室溫下,在37℃恒溫水浴中,將組織塊放入酶液Ⅰ中消化10-12min,用無鈣臺式液中止消化,迅速轉(zhuǎn)入酶液Ⅱ中消化6-8min,用無鈣臺式液中止消化,再用尖端圓滑的玻璃吸管輕輕吹打,將細胞懸液連同組織滴于載玻片上,當(dāng)在倒置顯微鏡下觀察到組織上細胞之間連接較松散,且有多個單個膜光滑、折光性好的細胞時,即可中止所有的消化,將細胞懸液放于4℃冰箱中,靜置10-30min,再次輕輕吹打組織,將細胞懸液鋪于蓋玻片上,放于4℃冰箱中備用[3-4]。

1.2.1.2 F型膠原酶法

酶液Ⅰ中消化9-12min,酶液Ⅱ中消化6-8min,其余步驟同H型膠原酶法。

1.2.1.3 Ⅺ型膠原酶法

酶液Ⅰ中消化8-10min,酶液Ⅱ中消化4-6min,其余步驟同H型膠原酶法[4]。

1.2.2 人體腸系膜動脈平滑肌細胞形態(tài)學(xué)觀察

1.2.2.1 單通道膜片鉗實驗

玻璃微管電極用微管電極拉制器(日本PC-10,NARISHIGE)兩步拉制,充灌電極液后電極尖端阻抗約10-15 MΩ。取酶分離后24 h內(nèi)的人體腸系膜動脈平滑肌細胞,室溫20-25℃,細胞內(nèi)外為140 mM對稱性高鉀溶液下進行實驗。將貼有細胞的蓋玻片放入盛有1ml浴液的實驗小槽中,在倒置相差顯微鏡下找到貼壁好、折光性好、膜光滑的細胞,用微推進器控制電極接近細胞,給予電極尖端約10-20 cmH2O的負(fù)壓,使玻璃微管電極尖端與細胞間形成電-化學(xué)絕緣,阻抗達到10-100gΩ,即形成了細胞貼附式膜片(Cell-attached patch),將電極尖端提出液面于空氣中暴露數(shù)秒,再放入浴槽,即形成內(nèi)面向外式膜片(Inside-out patch)。

1.2.2.2 穿孔全細胞膜片鉗實驗

玻璃微管電極用微管電極拉制器(日本PC-10,NARISHIGE)兩步拉制,電極尖端沖灌含二性霉素的全細胞電極液,阻抗約3-5 MΩ。在室溫下,先形成細胞貼附式膜片(Cell-attached patch),約3-20min,可以看到膜電容出現(xiàn)并逐漸增大,而Rs則逐漸變小,提示穿孔膜片正在逐漸形成,20-30min后,膜電容瞬變值和Rs都趨于穩(wěn)定,這時連續(xù)施加超極化脈沖,可觀察到宏觀電流,表明電極內(nèi)液與細胞內(nèi)液相通,穿孔全細胞膜片(Whole cell patch)完全形成[5]。

2 結(jié)果

2.1 人體腸系膜動脈平滑肌細胞應(yīng)用于單通道膜片鉗實驗記錄到的BKCa電流,如圖1和圖2所示。

圖1 在inside-out patch下記錄H型膠原酶法分離的人體腸系膜動脈平滑肌細胞 BKCa電流圖

2.2 人體腸系膜動脈平滑肌細胞應(yīng)用于穿孔全細胞膜片鉗實驗記錄到的STOCs和BKCa電流[6],如圖3所示。

3 討論

單細胞越來越廣泛的應(yīng)用于科學(xué)研究的各個領(lǐng)域,相對于器官組織水平而言,單個細胞研究避免了神經(jīng)體液調(diào)節(jié)的干擾,研究者可以隨意改變細胞內(nèi)外環(huán)境,研究藥物濃度對細胞膜上各種離子通道的作用、細胞的跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細胞的生物電現(xiàn)象等。而要得到較高質(zhì)量的單個細胞是我們以上研究的必要前提條件,單個細胞的獲取受到多種因素的影響,比如環(huán)境的溫度、濕度、大氣壓、酶液的濃度、恒溫水浴箱的溫度、消化時間、組織塊的大小等。為了獲取較高質(zhì)量的單個平滑肌細胞,筆者結(jié)合從事多年的電生理學(xué)研究經(jīng)驗,總結(jié)出以上三種不同的急性酶分離方法,均能成功的分離出單個人體腸系膜動脈平滑肌細胞,并有效的應(yīng)用于電生理膜片鉗實驗中,且細胞封接穩(wěn)定,記錄電流的時間長,為單細胞的研究提供了實用而簡便的方法,也為今后的科研工作奠定了堅實的基礎(chǔ)。

1 楊艷,曾曉榮,劉智飛,等.酶分離豬冠脈平滑肌細胞鈣激活鉀通道全細胞記錄電學(xué)特性研究[J].瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2003,26(6)：473-476.

2 Yamamum H,Nagano N,Hirano M,et al.Activation of Ca2+dependent K+current by nordihydroguaiare acid in porcine co ronary arterial smooth muscle cells[J].J Pharamacol Exp T her.1999,29(1)：140-146.

3 Yang Y,Shui QL,Zeng XR,et al.Effects of neferine on potassium channels in guinea pig ventricular cells and porcine coronary artery smooth muscle cells[J].Chin J Pharma T oxico,2000,14(6)：405-410.

4 程俊,楊艷,曾曉榮,等.雌激素對人腸系膜平滑肌細胞鈣激活鉀通道的作用[J].黑龍江醫(yī)學(xué),2006,30(10)：749-752.

5 Cai F,Li PY,Yang Y,et al.Characteristic of spontaneous transient outward potassium currents in vascular smooth muscle cells of porcine coronary artery[J].Acta Phy siologica Sinica,2007,59(1)：27-32.

6 程俊,楊艷,曾曉榮,等.雌激素對正常人腸系膜血管平滑肌自發(fā)瞬時外向電流的作用[J].四川醫(yī)學(xué),2008,29(7)：797-799.