徐永茂 徐冬云 張南征 陳復(fù)興 劉軍權(quán)

肺癌是目前在全球范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率均居于首位的惡性腫瘤,并有逐年上升的趨勢(shì)。由于我國(guó)仍處于發(fā)展中國(guó)家,大多數(shù)患者就診時(shí)往往已是中晚期,失去手術(shù)機(jī)會(huì),隨著分子生物學(xué)及腫瘤免疫研究進(jìn)展,除了傳統(tǒng)的手術(shù)、放射治療、化療,近年來(lái)隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)理論及科研技術(shù)的發(fā)展,免疫治療再次引起了關(guān)注,并逐漸成為腫瘤綜合治療的 1個(gè)重要組成部分。為了提高晚期非小細(xì)胞肺癌患者的臨床療效,延長(zhǎng)生存期,改善患者的生活質(zhì)量,自 2004年 1月～2009年 7月,我科采用 NP方案聯(lián)合自體外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)的 CIK(cytokine-induced killers)細(xì)胞與樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)過(guò)繼免疫治療 38例晚期非小細(xì)胞肺癌患者,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 入組標(biāo)準(zhǔn)

經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)檢查證實(shí)的(國(guó)際抗癌聯(lián)盟1997年分期標(biāo)準(zhǔn))Ⅲ、Ⅳ期 NSCLC患者,卡氏評(píng)分≥70分,之前未行抗癌治療,血常規(guī)及肝腎功能均正常,無(wú)嚴(yán)重心肝腎疾病。根據(jù)患者臨床表現(xiàn)與體格檢查、胸部和腦部 CT或 MRI檢查、腹盆腔彩超或 CT或 MRI檢查、骨 ECT檢查結(jié)果進(jìn)行臨床分期。

1.2 一般資料

可評(píng)價(jià)的 78例中男性 57例,女性 21例,年齡 47～75歲,平均 59.6歲,鱗癌 34例 、腺癌 38例,大細(xì)胞癌 6例。其中Ⅲ期 24例,Ⅳ期 54例,隨機(jī)分為研究組38例與對(duì)照組 40例,治療前常規(guī)行胸部 CT、心電圖、血常規(guī)及肝腎功能檢查。所有接受過(guò)繼免疫治療患者,治療前均明確告知過(guò)繼免疫細(xì)胞治療的優(yōu)點(diǎn)和不足,患者或家屬簽署知情者同意書(shū),并報(bào)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 主要儀器與主要試劑、CIK細(xì)胞與 DC的制備

Foma311二氧化碳培養(yǎng)箱,Foma1205生物安全柜,COULTER公司 XL流式細(xì)胞儀,CS-3000PLUS血細(xì)胞分離儀;HumanTH 1/TH2 cytokine Kit由 BD公司提供。

1.3.1 CIK細(xì)胞制備方法 抽患者晨起后外周血 200 m l,分離血漿備用,再吸出富含白細(xì)胞層的細(xì)胞約 10 m l,懸浮于等量患者自身的血漿中,淋巴細(xì)胞分離液分離收集單個(gè)核細(xì)胞。剩余紅細(xì)胞用生理鹽水補(bǔ)充至原體積后回輸給患者。PBS洗滌,將細(xì)胞按 2×109個(gè)/L數(shù)量懸浮于 RPMI 1640完全培養(yǎng)中,加至經(jīng)抗 CD3單抗包被的 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔 6 ml,加入終含量為50 kU/L rIL-2和 50 kU/L IFN-γ,置于 37℃ 50ml/L的 CO2條件下培養(yǎng),培養(yǎng) 7天后,經(jīng)細(xì)菌和霉菌培養(yǎng)陰性后再收集細(xì)胞,無(wú)菌生理鹽水洗 3次,將細(xì)胞懸浮于自身的血漿中,加入 2×104U rIL-2,終細(xì)胞數(shù)為(1.3×109～1.6×109)個(gè)。靜脈回輸時(shí)配制成 150ml的細(xì)胞懸液,用輸血器 1 h內(nèi)輸入。

1.3.2 DC的體外培養(yǎng)方法 抽患者晨起后外周血200m l,先離心分離出血漿備用,再吸出富含白細(xì)胞層的細(xì)胞約5 ml,懸浮于等量患者自身血漿中,用淋巴細(xì)胞分離液分離收集單個(gè)核細(xì)胞。剩余紅細(xì)胞用生理鹽水補(bǔ)充至原體積后回輸給患者。單個(gè)核細(xì)胞用無(wú)菌生理鹽水洗滌 3次,用 RPMI 1640完全培養(yǎng)基將細(xì)胞配成 2×109/L,加入 6孔板細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔 5 ml,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育 2 h。再用預(yù)熱的培養(yǎng)基輕洗培養(yǎng)板 2次,即獲貼壁的單個(gè)核細(xì)胞,每孔加入完全培養(yǎng)液(含 200μg/L rhGM-CSF和 50μg/L rhIL-4)3m l。每 2天半量換培養(yǎng)液(含 200μg/L rhGM-CSF和50μg/L rhIL-4),在培養(yǎng)第 9d的樹(shù)突狀細(xì)胞中加入rhTNF-α至 10μg/L,15 h后收集 DC細(xì)胞進(jìn)行臨床腋窩淋巴結(jié)附近皮下注射。

1.4 方法

研究組:采用 NP方案,NVB(國(guó)產(chǎn)長(zhǎng)春瑞賓)25 mg/m2,靜脈推注,第 1、8天 ;DDP每天 25 mg/m2,靜脈點(diǎn)滴,第 1～3天,每 3～4周為 1個(gè)周期,第 2個(gè)周期化療結(jié)束 2周血像恢復(fù)正常后,抽外周血,分離單核細(xì)胞行 CIK細(xì)胞與 DC培養(yǎng),1周后回輸,每周 2次,共4～5周為 1個(gè)周期。2個(gè)周期化療與 1個(gè)周期的過(guò)繼免疫治療為 1個(gè)療程,治療 2個(gè)療程后開(kāi)始評(píng)價(jià)療效?；熎陂g及時(shí)復(fù)查血常規(guī),酌情應(yīng)用重組人粒細(xì)胞刺激因子升白細(xì)胞。

對(duì)照組:化療方法同研究組。

1.5 療效及毒性的評(píng)價(jià)

按 RECIST實(shí)體瘤的近期療效標(biāo)準(zhǔn)[1]分為完全緩解(CR)、部分緩解 (PR)、穩(wěn)定(SD)、進(jìn)展(PD)4級(jí),治療結(jié)束 1個(gè)月后進(jìn)行療效評(píng)價(jià)。疾病進(jìn)展時(shí)間(TTP)是指從治療開(kāi)始至病灶出現(xiàn)進(jìn)展的時(shí)間。療效為 CR和 PR的病例需繼續(xù)進(jìn)行治療,PD的病例停止研究。按照 WHO統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)毒性[2]。

1.6 觀察指標(biāo)

生活質(zhì)量變化;記錄患者癥狀及體征的變化,采用kamofsky計(jì)分方法判斷治療前及治療后的變化。

對(duì)治療前后的 T細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

療效采用非參數(shù)的秩和檢驗(yàn),研究組與對(duì)照組治療的生活質(zhì)量對(duì)比采用非參數(shù)的 χ2檢驗(yàn),計(jì)量資料以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示±s,組間差異采用 t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效

兩組均無(wú) CR病例,研究組中 PR 25例、SD 9例、PD 4例 ,有效率(RR=CR+PR)為 65.7%;對(duì)照組中PR 16例 、SD 15例、PD 9例 ,有效率為 40.0%,兩組有效率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,χ2=4.22)。兩組患者均獲得隨訪,研究組 TTP為 5.3個(gè)月、中位生存期 (MST)為 11.9個(gè)月(95%CI 6.5～15.6個(gè)月);對(duì)照組 TTP為 4.6個(gè)月、MST為 10.4個(gè)月(95%CI4.5～12.1個(gè)月),見(jiàn)表 1。

表1 兩組患者療效及生存率比較(例)

研究組與對(duì)照組 1、2年生存率分別為 39.4%、14.2%和 35.3%、12.6%,兩組比較無(wú)顯著性差異(P=0.65)。

2.2 不良反應(yīng)

骨髓抑制和胃腸道反應(yīng)是主要的不良反應(yīng),兩組白細(xì)胞下降發(fā)生率分別為 81.5%(31/38)和 80.0%(32/40),以Ⅰ ～Ⅱ度白細(xì)胞減少為主,應(yīng)用瑞血新(G-CSF)后均能完成治療。雖然預(yù)先應(yīng)用了止吐藥物,消化道反應(yīng)的發(fā)生率仍較高,主要為食欲下降、惡心,少數(shù)有一過(guò)性嘔吐,兩組胃腸道反應(yīng)發(fā)生率分別為76.3%(29/38)和 75.0%(30/40),以Ⅰ ～Ⅱ度胃腸道反應(yīng),主要表現(xiàn)為惡心、嘔吐(可控制)。

2.3 生活質(zhì)量變化

生活質(zhì)量以 kamofsky評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算,凡在治療后kamofsky評(píng)分提高超過(guò) 10分者為改善,而下降超過(guò)10分者為惡化,提高或下降少于 10分者為穩(wěn)定。kamofsky評(píng)分總提高率為改善 +穩(wěn)定。研究組中改善24例,穩(wěn)定 10例,進(jìn)展 4例。對(duì)照組中改善 15例,穩(wěn)定 13例,進(jìn)展 12例。研究組與對(duì)照組治療后 kamofsky評(píng)分總提高率分別為 89.4%與 70.0%,2組比較有顯著性差異(χ2=4.56,P＜0.05)。

2.4 T細(xì)胞亞群變化

兩組治療前后 T細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表 2。

表2 2組治療前后T細(xì)胞亞群的比較±s,%)

表2 2組治療前后T細(xì)胞亞群的比較±s,%)

★為與研究組治療前比較,P＜0.05;▲為與對(duì)照組治療前比較,P＜0.05

組別 例數(shù) CD 3+ CD 4+ CD 8+ CD 4+/CD 8+研究組治療前 1周 38 53.48±6.87 31.09±6.59 29.49±3.45 0.99±0.36治療后 1個(gè)月 38 63.46±6.19★ 36.43±4.51★ 26.12±4.21 1.64±0.35★對(duì)照組治療前 1周 40 51.51±6.22 32.40±5.31 27.70±6.12 1.08±0.41治療后 1個(gè)月 40 54.28±6.31 33.52±4.44▲ 26.72±5.36 1.11±0.37▲

3 討論

過(guò)去肺癌的化療治療效果一直不理想,晚期非小細(xì)胞肺癌的中位生存期僅 4～6個(gè)月,近年來(lái)隨著長(zhǎng)春瑞濱等新藥進(jìn)入臨床使用,使晚期非小細(xì)胞肺癌的療效有較大的提高。長(zhǎng)春瑞濱是第 3代半合成的長(zhǎng)春生物堿,其作用機(jī)制是通過(guò)阻止微管蛋白聚合形成微管和誘導(dǎo)微管解聚,使紡鍾體不能形成,細(xì)胞停止于有絲分裂中期,從而抑制腫瘤的增殖[3],藥代動(dòng)力學(xué)研究顯示長(zhǎng)春瑞濱血漿清除率高,分布容積大,半衰期長(zhǎng),故廣泛分布全身,該藥在肝臟濃度最高,其次為肺,與順鉑有協(xié)同作用[4,5]。

肺癌的患者常呈現(xiàn)免疫功能抑制,免疫功能愈低者,還發(fā)生“免疫漂移”(immune shift)改變[6,7],即細(xì)胞免疫功能下降,體液免疫功能增強(qiáng),機(jī)體的抗腫瘤免疫受到嚴(yán)重干擾[8];T細(xì)胞亞群是構(gòu)成機(jī)體免疫防御的重要因素,兩個(gè)主要亞群,即輔助性 T細(xì)胞(Th)CD4+和抑制性細(xì)胞(Ts)CD8+。機(jī)體內(nèi)的免疫平衡主要由這兩類細(xì)胞相互間影響來(lái)維持。CD 4+T細(xì)胞具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的活性,輔助 B細(xì)胞產(chǎn)生抗體,分泌細(xì)胞因子的作用,而 CD8+則有免疫抑制和細(xì)胞毒性作用[7]。CD4+下降或 CD8+升高均可使兩者比例失調(diào),導(dǎo)致機(jī)體免疫功能缺陷。國(guó)內(nèi)外很多研究結(jié)果表明,多種腫瘤患者有 T細(xì)胞亞群狀態(tài)異常和比例失調(diào),其CD4+/CD8+比值的降低與病變程度相關(guān),往往提示患者的細(xì)胞免疫功能處于抑制狀態(tài),對(duì)識(shí)別和殺傷突變細(xì)胞的能力下降,從而有利于腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

CIK細(xì)胞兼有 T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性與 NK細(xì)胞的非主要組織相容性復(fù)合物(MHC)限制性殺瘤特點(diǎn),對(duì)某些腫瘤細(xì)胞殺傷活性可以達(dá)到 84.7%[9],DC是人體內(nèi)最有效的專職的抗原提呈細(xì)胞。成熟的DC可通過(guò) MHC-I、MHC-II類及 CD1分子途徑提呈腫瘤抗原,有效的啟動(dòng)抗腫瘤細(xì)胞免疫,并能分泌 Th1型細(xì)胞因子 IL-2和 TI-12,起到激活 T細(xì)胞應(yīng)答的作用。DC與 CIK細(xì)胞是腫瘤免疫治療的兩個(gè)重要部分,前者識(shí)別病原、激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng),后者通過(guò) MHC非限制性方式殺傷腫瘤細(xì)胞,兩者聯(lián)合形成了抗腫瘤免疫反應(yīng)體系了 1個(gè)高效的免疫反應(yīng)完成。培養(yǎng)的 CIK細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用的機(jī)制主要有:釋放具有細(xì)胞毒性的細(xì)胞質(zhì)顆粒物殺傷靶細(xì)胞;產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子直接或間接殺傷腫瘤細(xì)胞;表達(dá) Fasl,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。培養(yǎng)的DC能夠通過(guò)共刺激分子與細(xì)胞因子,促進(jìn)CIK細(xì)胞的殺傷活性;還能通過(guò)刺激抗原特異性 T細(xì)胞增殖,增加抗腫瘤效應(yīng)。從兩組的治療前后的 T細(xì)胞亞群的檢測(cè)結(jié)果,研究組的治療后的 CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均明顯高于治療前,研究組治療后的CD4+、CD4+/CD8+也明顯高于對(duì)照組的治療后。

單純的化療雖能有效地使腫瘤縮小,并能改善癥狀,延長(zhǎng)生存期,但隨著抗腫瘤藥物的廣泛使用,耐藥性成為臨床腫瘤化療失敗最常見(jiàn)和最難克服的問(wèn)題之一,而且化療實(shí)際上并不能完全殺傷所有的腫瘤細(xì)胞,尤其是腫瘤干細(xì)胞,化療對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷呈一級(jí)殺傷,而免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞呈 0級(jí)殺傷,因此被化療殺傷后殘存的癌細(xì)胞需要患者自身的免疫細(xì)胞來(lái)清除,但對(duì)于晚期肺癌患者,本身的免疫功能低下,而經(jīng)過(guò)化療后患者的細(xì)胞免疫功能進(jìn)一步低下,此時(shí)每周 2次回輸?shù)?CIK細(xì)胞與 DC,使患者細(xì)胞免疫功能得以回復(fù)與提高,從而進(jìn)一步殺傷或清除化療后那些殘存的癌細(xì)胞,來(lái)鞏固并提高效果。

本研究組近期有效率(65.7%)明顯高于對(duì)照組(40.0%),雖然研究組的 TTP(5.3個(gè)月)、MST(11.9個(gè)月)高于對(duì)照組的 4.6個(gè)月和 10.4個(gè)月,以及研究組 1、2年生存率(39.4%和 14.2%)分別高于對(duì)照組(35.3%和 12.6%),但兩組比較均無(wú)顯著性差異。而研究組的治療后患者的細(xì)胞免疫功能改善明顯高于對(duì)照組,研究組生存質(zhì)量的提高也明顯高于對(duì)照組,患者的生活質(zhì)量提高,可以增強(qiáng)患者抗癌的信心,激發(fā)性自身的免疫功能,從而使患者有更好的依從性。

通過(guò)以上本研究結(jié)果分析提示,對(duì)于中晚期的非小細(xì)胞肺癌,采用化療聯(lián)合培養(yǎng)的 CIK細(xì)胞與樹(shù)突狀細(xì)胞過(guò)繼免疫抗癌治療,可以取得較好的臨床療效,提高患者免疫功能,改善患者的生存質(zhì)量,可以延緩患者的生存期,是 1個(gè)值得推廣的治療方法。

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