肖江衛(wèi) 王崇樹 魏壽江 王 城 周 彤 李勁東 彭 勇

芬戈莫德(FTY720)是 1種小分子的免疫調(diào)節(jié)劑,它是從冬蟲夏草中分離出來的活性成分 ISP-1,經(jīng)過化學(xué)改造而得來[1]。目前已臨床應(yīng)用于抑制實(shí)體器官的移植免疫排斥。最近的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),FTY720還具有多種腫瘤抑制效應(yīng),如抑制乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移[2]、抑制前列腺癌的侵襲[3]和誘導(dǎo)人膀胱癌的凋亡[4]等。但國內(nèi)外 FTY720對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制效應(yīng)尚研究不多,而且機(jī)理未明。本實(shí)驗(yàn)通過 FTY720對(duì)裸鼠肝移植瘤的抑制作用進(jìn)行研究,并進(jìn)一步闡明其分子機(jī)制,從而為臨床治療肝癌提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 選取健康、雄性、體重 20 g的 SPF級(jí)裸鼠 32只,裸鼠由香港大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、Caspase 3以及 Phospho-Akt(Ser473)單克隆抗體(均購自美國 eBioscience公司)、原位細(xì)胞 TUNEL檢測試劑盒(購自瑞士 Roche公司)等。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)分組 將種植腫瘤 1周后的荷瘤裸鼠隨機(jī)分入 3組,每組各 10只。3個(gè)組分別為:生理鹽水對(duì)照組、FTY720治療組 (5mg/kg)、FTY720治療組(10mg/kg)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 裸鼠肝臟移植瘤的制備[5]將體外培養(yǎng)的MHCC-97H(metastatic human hepatocellular carcinoma 97H)細(xì)胞系 1×107注射于裸鼠皮下,待腫瘤生長至1.0 cm左右,在無菌含 DMEM培養(yǎng)皿中將腫瘤切至0.1cm左右大小均勻的瘤塊,然后將瘤塊種植入裸鼠的左肝外葉,植入腫瘤后 1周的裸鼠再進(jìn)行藥物治療。

1.2.2 常規(guī)組織病理學(xué)及免疫組織化學(xué)檢查 常規(guī)蘇木精-伊紅染色(HE staining),顯微鏡下觀察腫瘤的組織形態(tài)學(xué)改變;采用免疫組織化學(xué)方法,檢測增殖細(xì)胞核抗原 (PCNA)、Caspase 3、Phospho-Akt(Ser473)表達(dá)水平變化。隨機(jī)選取 3個(gè)高倍鏡視野(400×)計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞占總腫瘤細(xì)胞的百分比,并比較各組陽性細(xì)胞百分比的差異。

1.2.3 TUNEL法檢測移植瘤凋亡水平變化 通過原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(TUNEL法)檢測移植瘤凋亡水平變化。結(jié)果判定:陽性反應(yīng)為胞核有棕黃色顆粒沉積,并隨機(jī)選取 3個(gè)高倍鏡視野(400×)計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞占總腫瘤細(xì)胞的百分比,并做比較。

1.2.4 Phospho-Akt、Caspase3mRNA表達(dá)水平變化的檢測 采用 Trizol總 RNA提取法提取總 RNA。然后將 3μg總 RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。取 2μl cDNA加入25μl的 PCR擴(kuò)增體系內(nèi),按表 1中反應(yīng)條件進(jìn)行。取 4μl擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量濃度為 15 g/l的瓊脂糖凝膠(內(nèi)含 0.5μg/m l的溴化乙錠)電泳,時(shí)間 20～25 min,電壓 100V,采用 Genesnap凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶的密度,計(jì)算產(chǎn)物的相對(duì)量:產(chǎn)物相對(duì)量 =產(chǎn)物電泳條帶密度/β-actin產(chǎn)物電泳條帶密度。

表1 Phospho-Akt和 Caspase 3的引物序列及反應(yīng)條件

1.2.5 腫瘤體積測定及比較 用游標(biāo)卡尺測定腫瘤最長徑 L和最短徑 W,以公式 V=L×W2/2計(jì)算腫瘤體積,計(jì)算出各組腫瘤的平均腫瘤體積并進(jìn)行比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單向方差分析(One-way ANOVA),陽性細(xì)胞所占百分比的比較采用χ2檢驗(yàn),腫瘤平均體積采用 t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:磷酸化 Akt蛋白(Phospho-Akt)在 FTY720治療組(5mg/kg和 10 mg/kg)表達(dá)水平低于生理鹽水對(duì)照組(P均 ＜0.05),而Caspase-3在 FTY 720治療組 (5mg/kg和 10mg/kg)表達(dá)水平明顯高于生理鹽水對(duì)照組(P均 ＜0.05),而增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)在 FTY720治療組(5 mg/kg和 10mg/kg)表達(dá)水平要低于對(duì)照組 (P均 ＜0.05),提示FTY720可抑制激活的 PI3K-Akt信號(hào)通路,上調(diào)Caspase-3表達(dá)水平,誘導(dǎo)增強(qiáng)癌細(xì)胞凋亡,同時(shí)抑制降低腫瘤細(xì)胞增殖水平,見圖 1～3。

圖1 3組磷酸化 Akt蛋白表達(dá)比較

圖2 3組 Caspase-3蛋白表達(dá)比較

2.2 TUNEL法凋亡檢測結(jié)果

TUNEL法凋亡檢測結(jié)果顯示,FTY720治療組(5 mg/kg和 10mg/kg)凋亡水平明顯上調(diào),遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于生理鹽水治療組(P＜0.05和 P＜0.001),尤以 10mg/kg更為顯著,見圖 4。

2.3 腫瘤組織中 Phospho-Akt和 Caspase-3的 mRNA表達(dá)情況

根據(jù) RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳圖繪制直方圖(圖5)。FTY 720治療組(5mg/kg和 10mg/kg)的 Phospho-AktmRNA表達(dá)水平明顯受到抑制(P均 ＜0.05),而Caspase-3 mRNA表達(dá)水平明顯高于生理鹽水對(duì)照組(P均 ＜0.05),提示 FTY720可以明顯地抑制激活的PI3K-Akt信號(hào)通路,上調(diào) Caspase-3表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

2.4 治療結(jié)束后各組腫瘤體積的比較

采用 FTY720治療 1個(gè)月后,處死裸鼠,并用標(biāo)尺測量了腫瘤的長徑和短徑,以公式 V=L×W2/2計(jì)算腫瘤體積并做比較。由圖 6可見,與生理鹽水治療組比較,FTY720治療組(5mg/kg和 10 mg/kg)明顯地抑制了腫瘤生長(P均 ＜0.05)。

圖3 3組PCNA蛋白表達(dá)比較

圖4 對(duì)照組和 FTY 720治療組TUNEL法陽性細(xì)胞百分比比較

圖5 對(duì)照組和治療組的磷酸化 Akt和 Caspase-3m RNA表達(dá)水平比較

圖6 對(duì)照組和FTY720治療組腫瘤平均體積比較

3 討論

原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是目前全世界第三大致死性腫瘤,也是我國最常見的惡性腫瘤之一。傳統(tǒng)肝臟部分切除手術(shù)一直是治療肝癌的首選方法,但肝癌的總體手術(shù)切除率僅有 20%左右,術(shù)后總體生存率也一直不高,其 5年生存率介于 13%～46%,術(shù)后容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,難以實(shí)現(xiàn)根治[6]。

FTY720作為最近幾年開發(fā)出來用于免疫抑制的藥物,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床抗器官移植免疫排斥。但其腫瘤抑制效應(yīng)最近才被科學(xué)家所發(fā)現(xiàn),人們已發(fā)現(xiàn)它對(duì)多種腫瘤有抑制作用。Terence等[5]證實(shí) FTY720對(duì)于多種肝癌腫瘤細(xì)胞系有明顯地抑制作用。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示 FTY720對(duì)于人高轉(zhuǎn)移性地肝癌細(xì)胞系 MHCC-97H移植瘤具有明顯地抑制作用,能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,減緩和抑制移植瘤的生長。FTY720的治療劑量為 5 mg/kg時(shí),即可達(dá)到 4倍左右的腫瘤體積抑制效應(yīng),而當(dāng)劑量提高到 10mg/kg是可以達(dá)到10倍左右的抑制效應(yīng),而裸鼠可以完全耐受治療,取得比較滿意地腫瘤治療效果。

有研究發(fā)現(xiàn) FTY720能明顯地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡與 Caspase-3、Caspase8以及Bid的活化密切相關(guān),而并不依賴于 Fas途徑,但對(duì)bcl-2具有依從性,bcl-2的過量表達(dá)可以抑制凋亡[7]。Matsuoka等[8]發(fā)現(xiàn) FTY720可以誘導(dǎo)人 T細(xì)胞白血病腫瘤細(xì)胞系 Jurkat細(xì)胞系出現(xiàn) G0/G1期生長抑制,它通過促進(jìn) Akt、Bad和核糖體 p70S6激酶脫磷酸化,同時(shí)使 PPA2或 PPA2樣的磷酸酶被激活,進(jìn)而促進(jìn)經(jīng)由線粒體的細(xì)胞凋亡。Azuma等[2]研究發(fā)現(xiàn) FTY720在抑制乳腺癌細(xì)胞系生長過程是呈劑量依賴關(guān)系的,FTY720治療后改變了腫瘤細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu),整合素明顯減少,這些改變將干擾腫瘤細(xì)胞的黏附,特別是對(duì)層黏連蛋白的黏附,從而阻斷了腫瘤細(xì)胞在靶組織中的著床、播散和轉(zhuǎn)移。此外,FTY 720還可能是通過抑制細(xì)胞外的信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[9]。FTY720的抗腫瘤作用與目前常用的化療藥物作用機(jī)制不同。FTY720誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡而不影響造血系統(tǒng)其它細(xì)胞系如粒細(xì)胞、紅細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,也不抑制骨髓,說明誘導(dǎo)的凋亡并不是基于細(xì)胞毒作用的,FTY720可能激活了存在于腫瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞之間的某種凋亡途徑。

近年來發(fā)現(xiàn),PI3K和其下游分子蛋白激酶 B(PKB或 Akt)所組成的信號(hào)通路與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。該通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活,其活性異常不僅能導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,而且與腫瘤細(xì)胞的遷移、黏附、腫瘤血管生成以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解等相關(guān)[10]。細(xì)胞凋亡是控制過度增殖的 1種正常細(xì)胞功能,癌細(xì)胞具有多種抑制凋亡、延長其存活的機(jī)制。Akt主要作用于抗凋亡通路,顯性負(fù)效應(yīng) Akt通過多條途徑誘導(dǎo)抑制凋亡,而腫瘤細(xì)胞中 PI3K-Akt信號(hào)通路常處于激活狀態(tài),腫瘤細(xì)胞的凋亡受到抑制,處于持續(xù)增殖無控制狀態(tài)。我們的研究結(jié)果表明 FTY720確實(shí)可以下調(diào)處于激活 PI3K-Akt信號(hào)通路,促使蛋白激酶脫磷酸化,從而釋放腫瘤細(xì)胞的凋亡抑制狀態(tài),促進(jìn)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。同時(shí)能夠誘導(dǎo)活化 Caspase-3,表現(xiàn)出明顯地抗腫瘤效應(yīng)。但 FTY720具體分子機(jī)制仍不完全明了,還需要進(jìn)一步地深入研究。

總之,FTY720不僅具有免疫抑制作用,而且還具有抗腫瘤效應(yīng)。FTY720不僅可以用于抗器官移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng),而且能抑制移植術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,這對(duì)肝癌肝移植患者更具重要意義。

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