孫正魁 馬行天 唐 華 姚榛祥

乳腺癌干細胞能夠發(fā)生侵襲、遷移,從而產(chǎn)生遠處的轉移病灶。對乳腺組織和乳腺癌標本的基因表達檢測發(fā)現(xiàn),CD44+CD24-/low的干細胞中間質細胞標志物呈高水平表達。我們采用乳腺癌干細胞體外模型,探討乳腺癌干細胞的上皮-間質轉化標志物表達、遷移及侵襲能力的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

人 MCF-7乳腺癌細胞系購自上海中國科學院細胞庫,優(yōu)級胎牛血清購自杭州四季青公司,DMEM和DMEM/F12培養(yǎng)基分別購自 Hyclone和 Gibco公司,EGF和 FGF購自 PeproTech公司,超低黏附 6孔培養(yǎng)板購自 Corning公司,CD24-PE和 CD44-FITC抗體購自 BD公司,鼠抗人 E-鈣黏素(E-cadherin)、鼠抗人 N-鈣黏素(N-cadherin)、鼠抗人纖維連接蛋白(Fibronectin)、鼠抗人波形蛋白(Vimentin)、鼠抗人 β-actin單克隆抗體和 HR標記的兔抗鼠 Ig多抗購自 Santa cruz公司,Western blot增強放光試劑購自北京中山公司,Transwell小室和 Matrigel購自 BD公司。

1.2 方法

1.2.1 MCF-7細胞系中乳腺癌干細胞的分離培養(yǎng)和傳代 取含血清培養(yǎng)基(為 DMEM培養(yǎng)基,添加了 5 U/L胰島素和 10%的優(yōu)級胎牛血清)中培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期的 MCF-7細胞,用胰酶-EDTA消化成單細胞懸液。經(jīng)臺盼藍染色并計數(shù)后重懸于干細胞培養(yǎng)基(在 DMEM/F12中添加 5 U/L胰島素、20 U/L EGF和10 U/L bFGF)中,以 1×105個 /ml接種于超低黏附培養(yǎng)板,放入 37℃、5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當培養(yǎng)板中形成細胞球后,將其用胰酶-EDTA消化并機械吹打成單細胞懸液并重懸于干細胞培養(yǎng)基中,仍以 1×105個/ml的濃度接種于超低黏附培養(yǎng)板中。連續(xù)傳代至 5代以上。

1.2.2 乳腺癌干細胞的有血清誘導分化 將培養(yǎng)出的第 5代細胞球用 PBS液沖洗后,用胰酶-EDTA消化成單細胞懸液,重懸于含血清培養(yǎng)基中,單細胞按照 1×105個/孔接種于 6孔板。每天用倒置相差顯微鏡觀察其分化和生長情況。當細胞貼壁、分化并處于對數(shù)生長期時在含血清培養(yǎng)基中連續(xù)傳代。

1.2.3 乳腺癌干細胞鑒定 取親本 MCF-7細胞、第 5代 MCF-7微球體細胞、微球體細胞分化培養(yǎng)后傳代到第 3代的 MCF-7細胞,每組細胞 5復孔,均經(jīng)胰酶-EDTA消化成單細胞懸液后,取 5×105的單細胞均以20μl/m l的濃度加入 CD24-PE和 CD44-FITC抗體進行標記,避光 20min后用 PBS液洗 2遍,1%的多聚甲醛重懸,FACSCalibur流式細胞儀檢測。取細胞球在SSM中貼壁分化的細胞至第 3代細胞,采用同樣的方法檢測分化后 CD44+CD 24-細胞含量。

1.2.4 Western blot檢測 E-鈣黏素 、N-鈣黏素 、纖維連接蛋白、波形蛋白的表達 收集轉染親本 MCF-7細胞、第 5代 MCF-7微球體細胞、微球體細胞分化培養(yǎng)后傳代到第 3代的 MCF-7細胞,每組細胞數(shù)為 5×105,用去污劑裂解緩沖液[50 mmoL/L Tris-HCl(pH 8.0),150mmol/LNaCl,1 g/L SDS,100 mg/LPMSF,1 mg/L Aprotinin,10 g/LNP-40]裂解細胞,提取總蛋白。紫外吸收法進行蛋白定量,調(diào)整濃度至 4 g/L。取25μl總蛋白,80 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后,轉移至 PVDF膜,按蛋白質分子質量 Marker將 PVDF膜剪開,按次序分別用一抗(鼠抗人 E鈣黏素、鼠抗人 N鈣黏素、鼠抗人纖維連接蛋白、鼠抗人波形蛋白、鼠抗人 β-actin)和二抗(兔抗鼠 IgG-HRP)孵育膜。最后將膜與 Western blot發(fā)光試劑作用,X線膠片曝光,顯影、定影,掃描入計算機,應用 SigmaGel軟件分析相對積分光密度。實驗重復 3次。以目的基因的積分光密度/β-actin的積分光密度值為相對光密度值,然后再以親本 MCF-7細胞的相對光密度值為 1,計算 MCF-7微球體細胞、分化的 MCF-7細胞的 E-鈣黏素、N-鈣黏素、纖維連接蛋白和波形蛋白相對表達量。

1.2.5 腫瘤細胞遷移和侵襲實驗 細胞遷移實驗采用帶 12μmol/L孔聚碳酸酯膜的 Transwell小室,下室內(nèi)加入含血清培養(yǎng)基 200μl,上室內(nèi)分別加入各組細胞 1×104及無血清培養(yǎng)基(為 DMEM培養(yǎng)基,添加了5 U/L胰島素)200μl,每組細胞 5復孔。細胞侵襲實驗預先用 Matrigel包被 Transwell小室的聚碳酸酯膜,其它步驟同細胞遷移實驗。Transwell小室放入 37℃、5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中孵育 48 h后取出,切下聚碳酸酯膜,將濾膜底部用 4℃丙酮固定 5 m in,蘇木精染色。在顯微鏡 20倍物鏡視野下計數(shù)隨機 5個視野的細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。組間比較采用 One-Way ANOVA法,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MCF-7在無血清懸浮培養(yǎng)下形成能夠連續(xù)傳代的細胞球

把 MCF-7細胞接種于超低黏附培養(yǎng)板的干細胞培養(yǎng)基中,在不同時間點用倒置相差顯微鏡觀察 MCF-7細胞生長情況。24 h后,開始形成少量的細胞球,但仍有部分細胞貼壁。72 h后,產(chǎn)生大量的懸浮細胞球,細胞球體積明顯增大,基本沒有貼壁細胞。將細胞球用胰酶-EDTA消化后并傳代,在用 SFM中可反復形成細胞球。用 SSM常規(guī)培養(yǎng)的 MCF-7細胞在 24 h后全部貼壁,48 h后形成單層細胞,有少量的懸浮細胞,但沒有細胞球形成,見圖 1。

2.2 MCF-7細胞球在有血清的培養(yǎng)基中貼壁分化

將獲得的細胞球細胞接種于含血清培養(yǎng)基中,48 h后,部分細胞貼壁,仍有大量的懸浮細胞球。72 h后,細胞貼壁并與周圍細胞融合,細胞形態(tài)在顯微鏡下與在 SSM中常規(guī)培養(yǎng)的 MCF-7細胞無明顯區(qū)別,見圖1。

圖1 3組細胞顯微鏡下代表性圖片

2.3 MCF-7細胞球中 CD44+CD24-細胞的含量

正常 SSM中培養(yǎng)與用微球細胞分化培養(yǎng)的細胞中 CD44+CD 24-細胞的含量無顯著差異,分別為(2.16±0.33)%和(2.85±0.69)%。而微球體細胞中CD44+CD24-細胞的含量顯著增高,為(76.01±4.67)%,與其它 2組比較,差異均有統(tǒng)計學意義,P均＜0.01,3組細胞流式細胞儀檢測圖見圖 2。

圖2 3組細胞流式細胞儀檢測圖

2.4 MCF-7細胞球細胞上皮和間質標志物的表達

MCF-7微球細胞中 E-鈣黏素表達水平下調(diào),與親本 MCF-7和分化后的 MCF-7細胞比較,差異均具有統(tǒng)計學意義,P均 ＜0.01;而 N-鈣黏素、纖維連接蛋白、波形蛋白的表達水平上調(diào),與親本 MCF-7和分化后的MCF-7細胞比較,差異均具有統(tǒng)計學意義,P均 ＜0.05,見圖 3、圖 4。

圖3 3組細胞上皮及間質標志物表達變化

圖4 3組細胞上皮及間質標志物電泳圖

2.5 MCF-7細胞球細胞的遷移和侵襲能力

Transwell小室穿膜實驗是檢測腫瘤遷移、侵襲能力的體外模型,由圖 5可見,本研究中 MCF-7微球體細胞的遷移和侵襲能力顯著增強,與親本 MCF-7和分化后的 MCF-7細胞比較,微球體細胞穿過聚碳酸酯膜和 Matrigel包被的聚碳酸酯膜的能力均顯著增強,差異均具有統(tǒng)計學意義,P均 ＜0.05。

圖5 3組細胞的遷移和侵襲能力比較

3 討論

研究顯示腫瘤組織及腫瘤細胞系中的細胞存在著不同分化階段的細胞,其中有一小部分的腫瘤細胞充當干細胞的角色,在啟動腫瘤形成和維持腫瘤生長中起決定性作用,被命名為腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSC)。2003年 Al-Hajj等[1]在轉移性乳腺癌中分離和鑒定出 CD44+/CD24-/lineage-的乳腺癌細胞群,這群細胞只需 200個就可以在 NOD/SCID鼠中形成腫瘤,而分選出該細胞群后的剩余的其它細胞無致瘤性,證實了乳腺癌干細胞的存在。隨后的研究發(fā)現(xiàn)早期乳腺癌患者的骨髓標本存在表達 CD44+CD24-的乳腺癌干細胞,其比例為 33%～l00%,而原發(fā)腫瘤中CD44+CD24-細胞的比例不超過 10%,提示乳腺癌患者轉移灶可能來自乳腺癌干細胞[2]。

上皮間質轉化現(xiàn)象(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是 1種基本的生理現(xiàn)象,在胚胎發(fā)育過程中參與器官塑型。近年來研究發(fā)現(xiàn),上皮間質轉化在乳腺癌侵襲轉移過程中也發(fā)揮了重要作用[3]。癌細胞發(fā)生上皮間質轉化主要特征表現(xiàn)在 E-鈣黏素的表達下調(diào),上皮細胞間連接解體,細胞分散。同時 N-鈣黏素、鈣黏素 6、鈣黏素 11等表達增強,形成細胞-基質黏附。以及間充質標志纖維連接蛋白、中間絲波形蛋白等表達上調(diào),細胞骨架重排,細胞運動能力增強[4]。這樣,癌細胞丟失上皮細胞特征、同時獲得間質細胞的某些特性,游走能力提高、與周邊或遠處間質組織的親和能力增強,進而造成遠處轉移。

已有研究表明,通過 EMT可使分化的乳腺上皮細胞獲得了癌干細胞的特征[5,6]。對正常乳腺組織乳腺癌標本進行系列基因表達分析發(fā)現(xiàn),CD44+CD24-/low干細胞高水平的表達間質細胞標志[6]。

我們根據(jù) Pontid等[7]的描述,采用添加細胞因子的無血清懸浮培養(yǎng)法,成功從 MCF-7乳腺癌細胞中培養(yǎng)出乳腺微球細胞。該乳腺微球細胞在無血清培養(yǎng)基中能夠連續(xù)傳代。該微球體細胞在有血清培養(yǎng)基中進行分化培養(yǎng),很快分化成貼壁的單層 MCF-7細胞。我們檢測了第 5代細胞球的相關表面標志,發(fā)現(xiàn)該微球體細胞含量約為 76%的 CD44+/CD24-的乳腺癌干細胞。應用這種乳腺癌干細胞的體外模型,我們采用Western blot方法檢測到 MCF-7微球體細胞 E-鈣黏素表達下調(diào),而 N-鈣黏素、纖維連接蛋白、波形蛋白的表達上調(diào),而 MCF-7微球體細胞分化后的 MCF-7細胞中E鈣黏素、N鈣黏素、纖維連接蛋白、波形蛋白的表達水平與親本 MCF-7細胞比較無顯著差別。我們的研究還發(fā)現(xiàn),與親本 MCF-7和分化后的 MCF-7細胞比較,MCF-7微球體細胞表現(xiàn)出顯著增強的遷移和侵襲能力。說明乳腺癌細胞誘導培育產(chǎn)生乳腺癌干細胞過程中發(fā)生了EMT,可能是乳腺癌干細胞獲得侵襲、轉移能力的基礎。因此,對乳腺癌干細胞與 EMT的關系的深入研究,可能為乳腺癌治療提供新的方向。

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