韓 燁，周志江，肖華志，王占忠

（天津大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院食品科學(xué)系，天津300072）

納豆是利用納豆菌對(duì)大豆原料進(jìn)行發(fā)酵而成，營(yíng)養(yǎng)豐富，易于消化，并具有特殊的生理功效，如抗癌、抗氧化性、溶血栓性、降血壓等，在亞洲具有悠久的歷史[1-2]。納豆菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，屬細(xì)菌科芽孢桿菌屬，好氧型，其原始菌株與枯草芽孢桿菌相同，是枯草芽孢桿菌的一個(gè)亞種[3]。

納豆究竟是起源于朝鮮半島還是日本不得而知，但其都是煮熟的大豆用稻草包好，利用稻草里的納豆菌在溫暖的環(huán)境下短期發(fā)酵而得到。如今，日本人已研究出納豆對(duì)身體健康的效用，把納豆發(fā)展為商業(yè)化產(chǎn)品，在最適溫度下，直接利用純種納豆菌接種，進(jìn)行大批量生產(chǎn)。而朝鮮半島以及我國(guó)東北朝鮮族的人們還是利用傳統(tǒng)的方法制作納豆，只在于家庭食用。本研究對(duì)已分離到的納豆菌Y-07進(jìn)行了發(fā)酵條件的優(yōu)化，旨在為改良民間制作納豆的方法打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌種

菌種Y-07為天津大學(xué)食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室從吉林省朝鮮族自治區(qū)民間納豆制品中分離、篩選和保存的菌株，經(jīng)傳統(tǒng)的生理生化特性和分子生物學(xué)鑒定[4]，確定為納豆菌（Bacillus subtlis natto），并于LB培養(yǎng)基斜面保存。

1.2 主要儀器與試劑

BS124S分析天平、HH.B11-40電熱恒溫培養(yǎng)箱、7230G型分光光度計(jì)等。葡萄糖、蛋白胨、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)為國(guó)產(chǎn)試劑。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基為普通營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基。液體種子培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基。

4 種不同碳源蛋白胨培養(yǎng)基分別為2%的可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，其他成分相同，為1%蛋白胨、0.5%氯化鈉，pH 7.0～7.2。固體和半固體培養(yǎng)基分別為加入2%和0.8%的瓊脂粉。

4 種不同氮源的培養(yǎng)基分別將氮源換為同濃度的大豆蛋白胨、胰蛋白胨、硝酸銨、硫酸銨，其他成分不變。

上述培養(yǎng)基均采用121℃的高壓蒸汽滅菌25min。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 種子液培養(yǎng) 取斜面菌種，接種于液體種子培養(yǎng)基中，35℃，180 r/min搖床培養(yǎng)20 h。

1.4.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 接種量2%，35℃，180 r/min搖床培養(yǎng)。

1.4.3 制作納豆 精選優(yōu)質(zhì)東北大豆→清洗→浸泡過(guò)夜→蒸煮→瀝干→冷卻（37℃）→接種→發(fā)酵培養(yǎng)（35℃）→后熟→納豆成品。發(fā)酵第24，32，48 h 進(jìn)行觀(guān)察。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 還原糖的測(cè)定 1.3中4種液體培養(yǎng)基采用費(fèi)林試劑法從第16 h開(kāi)始每隔4 h測(cè)定菌液的碳水化合物濃度。

1.5.2 生物量測(cè)定方法 以接種前培養(yǎng)液為空白，測(cè)定各發(fā)酵液在600 nm處的OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源種類(lèi)對(duì)納豆菌發(fā)酵的影響

按細(xì)菌生長(zhǎng)特點(diǎn)，得到的發(fā)酵液含糖量逐漸降低。在細(xì)菌的對(duì)數(shù)期，主要是因?yàn)榧?xì)菌繁殖消耗碳水化合物，細(xì)菌進(jìn)入平穩(wěn)期后，不僅是細(xì)菌消耗，更主要是納豆菌分泌的各種酶分解營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。圖1中，在同一時(shí)間，不同培養(yǎng)液的碳水化合物濃度是不同的。其中，葡萄糖濃度隨時(shí)間的延長(zhǎng)變化最大，其次是蔗糖，麥芽糖和可溶性淀粉最小。由此判斷出，在納豆發(fā)酵時(shí)，添加適量葡萄糖，效果是最好的。但由于葡萄糖不如蔗糖經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，且蔗糖和葡萄糖的濃度差異并不大，在實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中，可適當(dāng)調(diào)整葡萄糖和蔗糖的比例后加入到要發(fā)酵的大豆中，可大幅度提高納豆的發(fā)酵率。

在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，只涉及到了葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和可溶性淀粉，這是實(shí)驗(yàn)室里最常用的、最易分解的淀粉。但試驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的在于改進(jìn)民間納豆的制備方法，對(duì)于商業(yè)化生產(chǎn)納豆和民間制備納豆，在經(jīng)濟(jì)上，這并不實(shí)惠。納豆生產(chǎn)后需低溫貯藏，一般為-2～-4℃或-18℃以下。在如此低溫條件下，為保持納豆的品性，接種的納豆菌在培養(yǎng)過(guò)程中，要產(chǎn)生大量芽孢。在培養(yǎng)基成分中,碳源及其濃度是影響芽孢形成的主要因素。與葡萄糖、乳糖等速效碳源相比較，在玉米淀粉、小麥淀粉等淀粉類(lèi)長(zhǎng)效碳源中，菌體生長(zhǎng)較慢，14～16 h時(shí)生長(zhǎng)進(jìn)入平穩(wěn)期，比葡萄糖、乳糖等速效碳源晚2～6 h。在芽孢形成方面,淀粉類(lèi)碳源的芽孢形成緩慢[5]，但相比于葡萄糖、蔗糖、麥芽糖等糖類(lèi)，玉米淀粉、小麥淀粉等淀粉類(lèi)比較經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。為提高產(chǎn)率，發(fā)酵前期可適當(dāng)加入糖類(lèi)物質(zhì)，同時(shí)為在短時(shí)期內(nèi)保證芽孢產(chǎn)率，要選擇碳水化合物做復(fù)配發(fā)酵底物。

2.2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)納豆菌發(fā)酵的影響

以葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基接種后分別在25，30，37，45℃下培養(yǎng)，其生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖2所示。由圖2可明顯看到，最佳培養(yǎng)發(fā)酵溫度是37℃。雖然在45℃培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)液最早進(jìn)入穩(wěn)定期，但之后便一直處于一個(gè)較低的水平。37℃培養(yǎng)溫度下，溶液的渾濁度始終比同時(shí)間培養(yǎng)條件下的其他培養(yǎng)液高，10 h后菌體則進(jìn)入了穩(wěn)定期和衰亡期。但是，培養(yǎng)溫度對(duì)納豆桿菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)有較大影響，當(dāng)溫度為25，30℃時(shí)，抗菌活性高，35℃以上時(shí)抗菌活性下降[6]。納豆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值在于其抑制沙門(mén)氏菌、痢疾菌及O157∶H7大腸桿菌等致病菌的作用，以及它所分泌的納豆激酶等能夠促進(jìn)人體健康，因此，發(fā)酵過(guò)程需要把溫度控制在35℃以下，使之保持良好的分泌生理活性物質(zhì)的狀態(tài)。為了保持納豆菌的繁殖速度為最佳，試驗(yàn)繼續(xù)采用37℃的培養(yǎng)溫度。

2.3 不同氮源種類(lèi)對(duì)納豆菌發(fā)酵的影響

將不同氮源的培養(yǎng)基接種培養(yǎng)，每隔4 h測(cè)定生物量，結(jié)果如圖3所示。大豆蛋白胨作為氮源時(shí)，菌株對(duì)其的利用速度較快，在16 h達(dá)到最大生長(zhǎng)量，明顯好于其他3種氮源；其次是胰蛋白胨。而納豆菌對(duì)無(wú)機(jī)氮源硝酸銨和硫酸銨的利用速度相對(duì)較慢，并且OD值一直處于較低的水平。因此，有機(jī)氮源可以促進(jìn)納豆菌生長(zhǎng)，并且利于納豆菌抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生[6]，由于大豆蛋白胨的成本低于胰蛋白胨，因此大豆蛋白胨可被選作最適氮源。

2.4 納豆成品制作

按照1.4.3方法發(fā)酵納豆，分為A，B 2組，其中A組加入1%的大豆蛋白胨、葡萄糖、蔗糖。結(jié)果如表1所示。

表1 納豆制品發(fā)酵現(xiàn)象的觀(guān)察

在制作納豆過(guò)程當(dāng)中發(fā)現(xiàn)，用改進(jìn)后的方法做出來(lái)的納豆，其發(fā)酵時(shí)間與效果明顯優(yōu)于用傳統(tǒng)方法做出來(lái)的納豆。A組納豆產(chǎn)絲情況良好，新鮮的納豆色澤金黃，口感酥軟，用筷子挑起時(shí)有很長(zhǎng)很長(zhǎng)的絲狀黏液物質(zhì)，其主要成分是類(lèi)果聚糖，即果糖和γ-多聚谷氨酸的混合物[7]。絲狀黏性物質(zhì)越多，說(shuō)明納豆的品質(zhì)越佳，發(fā)酵得越好。納豆本身的氨味非常濃厚，添加糖類(lèi)物質(zhì)后進(jìn)行發(fā)酵，可以改善納豆的口味。若糖類(lèi)物質(zhì)過(guò)多，會(huì)使納豆稍有甜味，但適當(dāng)添加時(shí)，糖類(lèi)物質(zhì)基本上都被分解，對(duì)口感影響不大。

納豆發(fā)酵達(dá)不到好的效果，可能是培養(yǎng)條件不是最佳條件，也可能是接種的菌株不是最優(yōu)良的菌株。試驗(yàn)初期應(yīng)該選好發(fā)酵菌株，進(jìn)行正向育種后再分離出菌株。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)室分離到的納豆菌Y-07以大豆蛋白胨和葡萄糖為最佳氮源和碳源；最適發(fā)酵溫度為35℃，既能保持納豆菌的最佳繁殖，又能保證生理活性物質(zhì)的分泌。

添加適當(dāng)比例的大豆蛋白胨和葡萄糖進(jìn)行納豆發(fā)酵，可以提高納豆制品的質(zhì)量，這是對(duì)納豆民間做法進(jìn)行改良的最終目的。

本實(shí)驗(yàn)室分離到的納豆菌Y-07，有待作為出發(fā)菌株，進(jìn)行正向育種，從而選育出更高產(chǎn)量的生產(chǎn)菌種。

［1］ 王聰，孔繁東，祖國(guó)仁，等.納豆激酶的研究現(xiàn)狀與展望[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2004，25（12）：17-20.

［2］ Fujita M，Hong K，Ito Y，et al.Thrombolytic effect of nattokinase on a chemically induced throbosismodel in rat[J].Biol-Pharm Bull，1995，18（10）：1387.

［3］ R.E.布坎南，N.E.吉布斯.伯杰細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)[M].8版.北京：科學(xué)出版社，1984：735.

［4］ 東秀珠，蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2001：44.

［5］ 孫梅，匡群，施大林，等.培養(yǎng)條件對(duì)納豆芽孢桿菌芽孢形成的影響[J].飼料工業(yè)，2006，27（8）：19-24.

［6］ 鐘青萍，佘世望，梁勝媛，等.納豆菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].生物學(xué)雜志，2001，18（6）：19-21.

［7］ 周建平，郭華.納豆黏液成分分析 [J].食品工業(yè)科技，2003，24（4）：32-34.