薛俊龍，田林君，張國權，王國艷，張李俊，劉一飛

（山西省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032）

隨著我國規(guī)?；?、集約化養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，依靠良好的疫苗和完善的免疫程序，病毒性傳染病基本得到控制。而細菌性傳染病尤其是雞沙氏門菌病（包括雞白痢、雞傷寒和雞副傷寒），由于抗生素可對其進行有效防治，從而忽視了對傳染源和傳播途徑的綜合防控，加之臨床抗菌素的不合理使用日趨嚴重，其已成為目前影響?zhàn)B雞業(yè)最常見的細菌性傳染病之一[1-3]，近年來呈現(xiàn)擴大流行的趨勢。

為了解山西省雞沙門氏菌病流行情況，本試驗對相關媒介材料和有代表性的養(yǎng)雞場進行了雞沙門氏菌病病原、傳播途徑等的分離、調查、分析和研究，旨在為科學防治提供一定依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂、SS瓊脂、營養(yǎng)肉湯、三糖鐵培養(yǎng)基、微量生化鑒定管，均購自杭州天和生物制品公司。BP增菌液和亞硒酸鹽增菌培養(yǎng)基（SF）基礎購自北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.1.2 雞沙門氏菌因子血清 它購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司，批號為20090201。

1.1.3 藥敏紙片 恩諾沙星、氨芐青霉素、卡那霉素、阿米卡星、慶大霉素、左旋氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、頭孢噻呋、大觀霉素、復方磺胺、新霉素，購自北京天壇藥物生物技術開發(fā)公司，批號為20090722。

1.1.4 試驗動物 1日齡蛋公雛（經平板凝集反應檢測，雞白痢和副傷寒均為陰性的種雞蛋孵出的雛雞）購自山西省軍區(qū)種雞場。

1.1.5 菌株分離材料 山西市場上銷售的部分濃縮飼料、全價配合飼料；部分種雞場2008—2009年正值生產的種雞泄殖腔棉拭子；部分種雞場2008—2009年正值生產的種雞所產種蛋；部分種雞場周齡內的父母代雛雞；部分種雞場、規(guī)?；唐冯u場雞舍地面和飼槽等環(huán)境；周齡內疑似雞沙門氏菌病死亡的臨床病例。

1.1.6 雞白痢、雞傷寒多價染色平板凝集試驗抗原 它為北京中海動物保健科技公司生產，批號為200801。

1.1.7 被檢血清 選自山西省境內7個父母代蛋種雞場，5個規(guī)?；唐返半u場。

1.2 方法

1.2.1 分離材料的采集

（1）選擇山西境內銷售的雞用濃縮飼料和全價飼料適量，于無菌包裝袋中，盡快送往實驗室。（2）選擇山西省規(guī)?；改复N雞場，對不同批次正值生產的種雞，以每批10只無菌采集泄殖腔棉拭子。（3）無菌采集來自不同祖代雞場的周齡內父母代雛雞泄殖腔棉拭子。（4）選擇有代表性的種雞場和商品蛋雞場，無菌采集雞舍地面和飼槽的樣本。具體方法是：在被選擇的雞舍地面和飼槽各選2個點，每點為5 cm×5 cm的正方形（規(guī)板），以滅菌的棉拭子蘸取BP前增菌液，在采樣點5 cm×5 cm的地面或飼槽上，滾動涂擦2次后，剪斷棉拭子手持端，使其落入試管的增菌液中[4]。（5）選擇部分種雞場的新鮮種蛋，實驗室無菌條件下取其卵黃0.5mL。（6）無菌操作采集疑似雞沙門氏菌病死亡的雛雞肝組織或膽囊，冷藏保存，3 h內進行培養(yǎng)分離。

1.2.2 實驗室分離培養(yǎng)

（1）將1.2.1的濃縮飼料、全價飼料，泄殖腔棉拭子，地面、飼槽棉拭子，種蛋卵黃經過24 h，37℃恒溫BP前增菌培養(yǎng)，接種于SF增菌液中24 h，無菌條件下接種于SS瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。（2）將死亡雛雞的病變肝組織或膽汁，無菌條件下接種于SS瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。

1.2.3 分離菌的培養(yǎng)特性 挑取SS瓊脂培養(yǎng)基上呈灰色、圓形、中心帶黑色的可疑菌落，接種于三糖鐵瓊脂斜面、營養(yǎng)肉湯等培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，觀察結果。

1.2.4 分離菌的生化試驗和血清型鑒定

1.2.4.1 形態(tài)及生化試驗 按常規(guī)方法進行形態(tài)結構與染色特性觀察；用分離菌的純培養(yǎng)物進行糖發(fā)酵試驗、靛基質試驗等生化反應。

1.2.4.2 運動性試驗 以滅菌的接種針蘸取細菌的純培養(yǎng)物，垂直穿刺接種于半固體培養(yǎng)基的瓊脂柱內，置37℃恒溫箱內培養(yǎng)18～24 h，取出觀察。運動性的細菌沿穿刺線向四周擴散生長，使培養(yǎng)基變混濁；無運動性的細菌只沿穿刺線生長，周圍的培養(yǎng)基仍保持澄清。

1.2.4.3 血清型鑒定 挑取典型三糖鐵培養(yǎng)物進行沙門氏A-F多價O診斷血清、O單因子血清玻片凝集反應，并設生理鹽水為對照進行觀察。

1.2.5 動物感染試驗 1日齡雛雞130只，隨機分為13組，第1～12組皮下接種培養(yǎng)18 h分離鑒定的沙門氏菌肉湯培養(yǎng)液0.2mL；第13組用同樣的方法接種生理鹽水作為對照。每6 h觀察發(fā)病和死亡情況，并記錄到24 h。

1.2.6 藥敏試驗 按WHO推薦的Kir-by-Baner方法進行[5]。

1.2.7 抗體檢測方法 采用平板凝集試驗，按常規(guī)方法進行[6]。

2 結果與分析

2.1 沙門氏菌實驗室分離結果

2.1.1 分離菌的培養(yǎng)及形態(tài)特性 共分離培養(yǎng)雞沙門氏菌媒介材料及病理材料961羽份，詳細結果列于表1。

BP增菌液有菌株生長，一般顯示淡黃色混濁。SF增菌液有菌株生長，培養(yǎng)液多呈現(xiàn)紅色并混濁。SS瓊脂上菌落呈灰色、邊緣整齊、多數(shù)菌落的中心帶有黑色。SS瓊脂上的可疑菌落三糖鐵（TSI）瓊脂培養(yǎng)特性為：底層變?yōu)辄S色，斜面維持原有的紅色，有的菌株培養(yǎng)基中有黑色硫化氫產生，有的菌株培養(yǎng)基底部高層有氣泡產生。同時接種于營養(yǎng)肉湯中，培養(yǎng)結果為：液體均勻混濁，不形成菌膜或菌環(huán)。半固體培養(yǎng)結果為皆無運動性。三糖鐵瓊脂細菌革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性小桿菌。

表1 沙門氏菌分離培養(yǎng)情況 羽份

2.1.2 生化鑒定 對TSI瓊脂培養(yǎng)基上符合沙門氏菌生長特征的177株菌中的91株做生化鑒定（飼料4株、環(huán)境3株、成雞拭子8株、種蛋7株、種雛拭子20株、病料49株），結果列于表2。

表2 91株分離菌生化鑒定結果

從表2可以看出，被檢菌株的生化反應結果皆符合雞白痢、雞傷寒沙門氏菌的生化特性，但其中菌株對麥芽糖、衛(wèi)矛醇、山梨醇、H2S的反應無論是同一種媒介材料和病料，還是不同的媒介材料都無規(guī)律。以菌株對麥芽糖生化反應為依據(jù)，區(qū)別雞白痢和雞傷寒沙門氏菌（即發(fā)酵麥芽糖的為雞傷寒沙門氏菌，否則為雞白痢沙門氏菌），本研究中雞白痢沙門氏菌占68.13%，雞傷寒沙門氏菌占31.87%。

表3 20株分離菌抗原血清型鑒定結果

2.1.3 血清型鑒定 將三糖鐵培養(yǎng)基上的177株菌與雞白痢、雞傷寒沙門氏菌陽性診斷血清進行玻板凝集反應，結果全部呈陽性凝集，并且大多呈強陽性凝集，鹽水對照凝集反應為陰性。對其中20株（飼料1株、環(huán)境1株、成雞拭子2株、種蛋2株、種雛拭子6株、病料8株）進行了抗原血清型分析，結果列于表3。

2.1.4 雛雞感染試驗結果 各組在皮下接種6 h后，部分雞出現(xiàn)不同程度精神萎頓、嗜睡的臨床病癥，到24 h可見部分死亡，詳細情況是：飼料組（第1，2組）3只、5只；環(huán)境組（第3，4組）4只、5只；成雞拭子組（第 5，6組）2只、4只；種蛋組（第 7，8組）5只、5只；種雛拭子組（第 9，10組）5只、7只；病料組（第11，12組）8只、9只；鹽水對照組（第13組）0只。死亡雞肝臟皆分離出了與接種菌同樣的沙門氏菌。

2.1.5 20株分離菌藥敏試驗結果 由表4可知，分離的20株雞沙門氏菌，對阿米卡星和頭孢噻呋的敏感率為100%；對卡那霉素、大觀霉素、新霉素、萬古霉素的敏感率為70%～90%；對氨芐青霉素的耐藥率為70%；對復方磺胺的耐藥率為90%。

2.2 規(guī)?；u場污染情況調查結果

2.2.1 7個種雞場血清學調查結果 表5顯示，被調查的山西省7個具有代表性種雞場的37 554只在最佳的檢測日齡，雞白痢、雞傷寒檢出陽性數(shù)為962只，占被檢數(shù)的2.6%。種雞場檢出陽性率最高的為47.8%，最低的為0.2%。

表4 20株分離菌對12種抗生素敏感性測定結果

表5 種雞場血清學調查結果

2.2.2 11個雞場商品蛋雞血清學調查結果 表6顯示，11個被調查的商品蛋雞場，在最佳的檢測日齡，2 441只被檢雞中雞白痢、雞傷寒陽性數(shù)為396只，占被檢數(shù)的15%。商品蛋雞場檢出陽性率最高的為35%，最低的為10%。

表6 商品蛋雞血清學調查結果

3 小結與討論

（1）雞沙門氏菌病（包括雞白痢、雞傷寒和雞副傷寒3種病）一直是雞的重要傳染病。本研究通過對雞沙門氏菌可能存在的媒介材料進行分離和鑒定，結果表明，被分離的媒介材料中皆有雞沙門氏菌病病原菌的存在，主要以雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌為主，血清型為09和012。這為從生物安全技術方面有效控制該病提供了科學依據(jù)。

（2）媒介材料中3日齡內的父母代種雞泄殖腔分離陽性率為20%，這應該是雞沙門氏菌病傳入山西省并造成蔓延的重要原因。提醒廣大養(yǎng)殖者選擇無雞沙門菌病的祖代或父母代種雞場引進雛雞；父母代雞場應切實做好雞白痢和雞傷寒的臨床凈化工作。

（3）父母代種蛋的分離陽性率為15%，飼料中致病菌的分離率約為5%，環(huán)境中為1.9%；病雞的陽性率為81%，成年雞肛拭陽性率為5.7%，這些媒介是沙門氏菌病在山西省水平傳播的重要因素之一。應加強飼料原料中病原菌的控制，嚴格雞舍的消毒、病死雞的無害化處理以及加強亞健康雞的預防和治療。

（4）雞沙門氏菌耐藥性的產生和致病性大腸桿菌一致，不僅是由長期的某種藥物選擇壓力所致，而且更多的情況是來源于細菌間耐藥質粒的轉移及多重耐藥性的影響，且隨著孵化雛雞而遷移[7-8]。因此，根據(jù)試驗結果，在科學用藥的前提下，今后相當長的時間內，防治雞沙門氏菌病可首選阿米卡星、頭孢噻呋、新霉素、萬古霉素等抗生素，盡可能避免使用耐藥率較高的復方磺胺、氨芐青霉素等；恩諾沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素等應通過藥敏試驗來選擇使用。

（5）本試驗調查的種雞場和商品蛋雞場涉及山西省的運城市、臨汾市、長治市、呂梁市、太原市、晉中市、忻州市養(yǎng)雞業(yè)較發(fā)達的地區(qū)，結果可以代表山西省的普遍狀況，共檢測父母代種雞37 554羽份，平均陽性率為2.6%，最高達到47.8%，母雞陽性率最高24%，雖然低于毗鄰的內蒙古自治區(qū)的平均陽性率13.6%，最高92.31%[9]，但也遠高于國家規(guī)定的種雞場雞白痢和雞傷寒陽性率0.2%的標準，說明山西省的雞白痢、雞傷寒的感染率也處于較高的水平，種雞場污染嚴重。所以，種雞場雞沙門氏菌病的凈化迫在眉睫。調查顯示，商品雞的陽性率明顯高于種雞，平均為15%。究其原因，經種雞場的垂直傳播是關鍵，最根本的是商品雞飼養(yǎng)者對沙門氏菌病的防控意識不強，獸醫(yī)衛(wèi)生、防治措施不力。

［1］ 周廷宣.后備種雞血清中沙門氏菌病抗體的檢測 [J].中國畜牧獸醫(yī)，2007（34）：87.

［2］ 王貴升，田夫林，陳靜，等.山東省規(guī)模養(yǎng)殖場沙門氏菌流行病學調查分析[J].家禽科學，2007（5）：11-13.

［3］ 方平，楊永莉，楊寶，等.Real-time PCR方法檢測肉品中的沙門氏菌[J].山西農業(yè)科學，2010，38（8）：71-76.

［4］ 傅先強，劉占軍.養(yǎng)禽場禽病檢驗手冊[M].北京：中國農業(yè)大學出版社，1992.

［5］ 馬興樹.禽傳染病實驗診斷技術[M].北京：化學工業(yè)出版社，2006：108-109.

［6］ 程安春，汪銘書，汪開毓，等.現(xiàn)代禽病診斷和防治全書[M].成都：四川大學出版社，1997：89-90.

［7］ 劉業(yè)兵，張文龍，潘志明，等.陜西關中地區(qū)雞白痢沙門氏菌的藥敏試驗[J].中國獸醫(yī)雜志，1999（2）：7-9.

［8］ 張秀珍.當代細菌檢驗與臨床[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：343-345.

［9］ 申之義，李利萍，張慶華，等.內蒙古地區(qū)雞沙門氏菌病流行病學調查[J].中國家禽，2000（10）：33-34.