陳利榮, 賈艷梅 (山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院教務(wù)處, 汾陽 0300; 山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系; 通訊作者,E-mail:clr98@63.com)

瘦素(leptin)是肥胖基因編碼的一種脂源性激素,瘦素受體(leptin receptor,LR)是 leptin的高親和力受體,是脂肪細(xì)胞分泌的具有保持機(jī)體能量平衡的激素,它們結(jié)合后方能發(fā)揮調(diào)節(jié)能量代謝和體脂平衡的作用。LR基因又被稱為糖尿病基因[1],于1995年被定位克隆[2]。人類 LR基因位于 1p31,長約 5.1 kb,含 20個外顯子,19個內(nèi)含子,編碼 1 165個氨基酸[3,4]。目前已在其 20個外顯子中發(fā)現(xiàn)了19種基因多態(tài)性,但關(guān)于該基因變異與人類糖尿病等的關(guān)系報道不一[5,6]。本實驗選擇 LR基因外顯子 20,檢測 +3057位核苷酸 G→A多態(tài)性,探討該變異與 2型糖尿病及血脂的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究以 130例山西省呂梁地區(qū)漢族人為研究對象,其中 DM組 68例(男 35例,女33例),年齡 36-70歲,根據(jù) 1999年 WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn),均為醫(yī)院就診者,排除家族性高脂血癥患者;正常對照組 62例(男 29例,女 33例),年齡32-64歲。均為門診健康體檢者,無其他疾病。DM組與正常對照組在性別和年齡上均無顯著差異。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床檢測 ①空腹血糖:采用美國臺欣血糖儀測定。②血脂的測定:總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)采用酶法測定;高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)采用直接測定法;低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)采用免疫透射比濁法。以上指標(biāo)均在同一臺日本 OLYMPUSAU640全自動生化分析儀進(jìn)行。

1.2.2 基因組 DNA的提取 用常規(guī)酚/氯仿法提取外周血基因組 DNA,應(yīng)用 751 GD紫外可見分光光度計檢測基因組 DNA的濃度和純度。

1.2.3 目的 DNA片段的 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為 25μl,其引物如下:上游引物:5′-ACT GTG GTC TCTCTACTT TC-3′;下游引物 :5′-CCA TGA GCT ATT AGA GAA AGA ATCCGT CAA-3′(大連寶生物公司合成)。用德國 SENSO產(chǎn) LABCYCLER MOTOR型梯度 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,經(jīng) 3%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色檢測 PCR基因產(chǎn)物。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的酶切及基因分型 ①酶切反應(yīng)在 12μl體系中進(jìn)行,內(nèi)切酶 Bsa HⅠ 65℃水浴消化 4 h。②聚丙烯酰胺凝膠電泳分型:按常規(guī)方法制備 8%中性聚丙烯酰胺凝膠,在室溫下,180 V恒壓,電泳5 h,銀染,紫外凝膠成像系統(tǒng)成像存檔,分析電泳結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 電泳后從凝膠上直接判讀個體的基因型,計算各等位基因頻率及基因型頻率。等位基因變異頻率比較用 χ2檢驗,組間比較采取 χ2檢驗,計量資料比較采取 F檢驗及 q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物的檢測及酶切結(jié)果 所設(shè)計引物摸索了適宜的 PCR條件,有較好的擴(kuò)增效果。不同個體 LR的擴(kuò)增片段大小均呈現(xiàn)一致的 276 bp帶型,沒有非特異性擴(kuò)增帶,可以直接進(jìn)行 RFLP電泳分析,結(jié)果見圖 1。

圖1 LR基因 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果(3%瓊脂糖凝膠)Fig 1 PCR product of LR gene(3%agarose gel)

PCR產(chǎn)物經(jīng) Bsa HⅠ酶切消化及聚丙烯酰胺凝膠(PCR-RF-SSCP)后,呈現(xiàn)多態(tài)性。依據(jù)條帶數(shù)和位置判定為 3種基因型,分別是 AA基因型(75 bp,201 bp),AG基因型(75 bp,173 bp,201 bp)和 GG基因型(28 bp,75 bp,173 bp),結(jié)果見圖 2。

圖2 LR基因外顯子20 PCR-RF-SSCP電泳檢測結(jié)果Fig 2 Electrophoresis results of LR gene by PCR-RF-SSCP

2.2 LR基因的 PCR-RF-SSCP各基因和基因型的分布與頻率 LR基因在 +3057位核苷酸 G→A變異,總的基因變異頻率(G→A)為 79.27%,DM組的變異頻率為 86.76%,正常對照組的變異頻率為71.77%,DM組 A等位基因頻率顯著高于正常對照組(χ2=6.19,P=0.016)。DM組中 AA型的頻率顯著高于正常對照組(76.47%vs 50.00%,χ2=7.33,P=0.026),而 GA型的頻率低于正常對照組(20.60%vs43.55%),結(jié)果見表1。

表1 LR基因PCR-RF-SSCP基因型頻率和基因頻率在不同組別中的分布Tab 1 Gene frequency and genotype frequency o f LR in different groups

2.3 LR基因多態(tài)性與 2型糖尿病及血脂的關(guān)系根據(jù) LR基因的 PCR-RF-SSCP結(jié)果呈現(xiàn)出的多態(tài),將研究對象分為 3個組:AA型組、GA型組、GG型組。AA基因型組甘油三酯高于 GA型組,高于 GG型(P＜0.05),而高密度脂蛋白低于 GA型組,低于GG型(P＜0.05),組間比較結(jié)果見表2。

表2 LR 3057位基因多態(tài)性與血脂的關(guān)系 (±s)Tab 2 Relationship o f LR 3057 gene polymorphisms with the b lood lipid level (±s)

表2 LR 3057位基因多態(tài)性與血脂的關(guān)系 (±s)Tab 2 Relationship o f LR 3057 gene polymorphisms with the b lood lipid level (±s)

與 AA型比較,*P＜0.05,**P＜0.01

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3 討論

LR是 leptin的高親和力受體,是 leptin發(fā)揮作用的重要中介物質(zhì)。自 1994年 LR基因被定位克隆以來,瘦素及其受體與肥胖及其相關(guān)疾病如高血壓、糖尿病、脂質(zhì)代謝紊亂等的關(guān)系成為近年來又一研究熱點。目前研究已經(jīng)證實了 LR基因多種突變和多個多態(tài)性位點[7-10]。Matsuoka等[6]應(yīng)用 PCR技術(shù)對日本肥胖病人 LR基因 2-20外顯子進(jìn)行擴(kuò)增測序分析發(fā)現(xiàn) 4種核苷酸順序變異,其變異頻率分別為 79%,91%,100%,85%,并研究了其變異與肥胖的關(guān)系,但未見相關(guān)性。Chen等[1]在美國人中發(fā)現(xiàn)瘦素受體基因突變,其中 3種氨基酸改變,3種靜息突變,還發(fā)現(xiàn) 4種內(nèi)含子序列變異。魯紅云等[11]發(fā)現(xiàn) LR第 +3057位核苷酸基因多態(tài)性可能通過影響機(jī)體局部體脂分布和脂質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)胰島素敏感性等參與 2型糖尿病的發(fā)生。Behn等[12]發(fā)現(xiàn)人該基因變異與早發(fā)性(≤45歲)糖尿病有關(guān)。Tumoi等[5]通過雜合雙向分析發(fā)現(xiàn),該基因變異不能解釋肥胖患者的胰島素抵抗,但參與葡萄糖不耐受的發(fā)生。

本結(jié)果表明,山西呂梁地區(qū)漢族人存在 LR基因變異,其中 20外顯子 +3057位核苷酸由鳥嘌呤(G)→腺嘌呤(A),變異頻率為 79.27%,DM組和正常對照組 +3057位基因變異頻率比較有顯著差異(86.76%vs71.77%,P＜0.05)。DM患者中 AA型頻率顯著高于對照組,而 GA型頻率低于對照組,病例組中 GG型頻率只有 2.94%。說明隨著等位基因 A的增加,患 2型糖尿病的危險性逐漸增加,提示 LR的 A等位基因可能是呂梁地區(qū)人群 2型糖尿病的遺傳易感標(biāo)記。另外本研究還發(fā)現(xiàn) AA基因型組甘油三酯高于 GA型組,高于 GG型組(P＜0.05),而高密度脂蛋白低于 GA型組,低于 GG型組(P＜0.05)。提示,其基因變異可能主要影響機(jī)體的體脂分布和脂肪代謝,并通過調(diào)節(jié)胰島素的敏感性來參與 2型糖尿病的發(fā)生。本次研究結(jié)果與國內(nèi)魯紅云等[11]、唐曉君等[13]、國外 Matsuoka等[6]的報道基本一致。

瘦素及 LR與多種正常生理功能的維持有著密切的關(guān)系。但由于人種和民族的不同、實驗技術(shù)和實驗方法等方面的限制,且由于瘦素受體基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜,變異多樣,對其與肥胖、2型糖尿病、脂質(zhì)代謝的關(guān)系,以及表達(dá)調(diào)控及信號傳導(dǎo)機(jī)制,對瘦素受體內(nèi)含子改變及其與外顯子的聯(lián)系,尚有待于更深入的研究。對瘦素作用的詳細(xì)機(jī)制以及與各種相關(guān)代謝途徑甚至癌癥發(fā)生關(guān)系的研究,LR的其他異型體與瘦素有何關(guān)系,尤其是在 LR功能異常時機(jī)體的代償反應(yīng)如何,可借助基因工程手段,如建立 LR其他異型體基因修飾小鼠模型進(jìn)行研究,弄清這些問題,有助于診斷和治療上述疾病,可為今后的基因治療提供新的思路。

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