詹光杰 湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院 (恩施 445000)

需氧生物在氧化還原循環(huán)中往往產(chǎn)生大量的超氧陰離子自由基(O2-)、羥自由基(OH)、過氧化氫 (H2O2)等活性氧。此外,酶促反應(yīng)、電子傳遞及小分子自身氧化等細(xì)胞正常的代謝過程也會產(chǎn)生活性氧?；钚匝跏亲杂苫闹匾M成部分,少量的自由基是生物體所必需的,它們作為第二信使,對信號傳導(dǎo)起重要的作用,影響基因的表達(dá),但是自由基的性質(zhì)極為活潑,過多的自由基如果不能被及時清除,它們將會攻擊各種生物大分子,引起 DN A損傷、酶失活、脂質(zhì)過氧化等一系列氧化損傷,進(jìn)而引起生物體各種生理病變[1～2]。

生物體在長期的進(jìn)化過程中,形成了一套完整的保護(hù)體系-抗氧化系統(tǒng)來清除體內(nèi)多余的活性氧。如超氧化物歧化酶(super oxide dismutase,SOD),谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)等。 SOD在清除活性氧反應(yīng)過程中第一個發(fā)揮作用,它將超氧陰離子自由基快速歧化為過氧化氫和分子氧;過氧化氫在過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶的作用下轉(zhuǎn)化為水和分子氧。所以,SOD和 GPX具有清除氧自由基,保護(hù)細(xì)胞不受氧化損傷的作用。而且其活性或含量的變化往往與生物體的免疫力是密切相關(guān)的。

板黨為桔?？泣h參屬植物,因生長在湖北恩施板橋而得名,其根含有豐富的多糖、甾醇、苷類、氨基酸、膽堿及微量元素等,是非常好的滋補(bǔ)品;續(xù)斷又名龍豆,為川續(xù)斷科草本植物,其成分含有三萜皂甙類、揮發(fā)油、甾醇類、生物堿、黃酮等有效成分,五鶴續(xù)斷因生長于特殊的地理生態(tài)環(huán)境的湖北省五峰縣和鶴峰縣而得名,其產(chǎn)量大、質(zhì)量優(yōu),是名副其實的道地藥材;天麻為蘭科植物,天麻的干燥塊莖古名赤箭,在我國有悠久的用藥歷史,主要成分為天麻素、香莢蘭醇、對羥基苯甲醛和對羥基芐醇等,近年來對抗衰老和促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶作用越來越受到重視;頭頂一顆株為百合科植物,主要成分含甾體皂甙和延齡草二葡萄糖甙,以根入藥。本實驗采用板黨、五鶴續(xù)斷、天麻及頭頂一顆株注射液給實驗動物腹腔注射,通過對各組動物組織超氧歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)含量測定的比較分析,探討其改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能、延緩衰老,進(jìn)而比較它們的差異性。

1 材料與方法 1.1 注射液制備 藥材由恩施州中藥材生產(chǎn) GAP(質(zhì)量管理規(guī)范)示范基地提供,采用水提醇沉淀法制成含生藥 30%的注射液,瓶裝密封消毒備用。

1.2 實驗藥品與儀器 氟哌啶醇注射液,湖南洞庭藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn);SOD、GPX試劑盒,南京建成生物工程研究所生產(chǎn);回避反應(yīng)箱,華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院提供;GL-20GII型高速低溫離心機(jī);UV-2450分光光度儀;水浴箱。

1.3 實驗分組 雄 Wistar大鼠 60只,鼠齡 40～ 50周,體重 300～ 350g(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物中心提供),隨機(jī)分對照組、模型組、板黨實驗組、五鶴續(xù)斷實驗組、天麻實驗組和頭頂一顆株實驗組 ,每組 10只。對照組生理鹽水 10只;模型組:氟哌啶醇 10只;實驗組氟哌啶醇+注射液各 10只。

1.4 電跳臺行為學(xué)訓(xùn)練及測試 實驗裝置為 30 cm×30cm回避反應(yīng)箱,箱底為銅柵,可通刺激電流。另有一高 5cm,頂端直徑為 5 cm的橡膠圓臺作為避電擊平臺,固定放置在箱內(nèi)一角的銅柵上,大鼠可在圓臺上停留以回避電擊。實驗開始時,先將大鼠輕放于回避反應(yīng)箱內(nèi),使其適應(yīng) 3～ 5 min以消除探究反應(yīng)。底部銅柵通電(36V)2s大鼠在受電擊刺激中逐漸學(xué)會跳上平臺回避電擊。多數(shù)大鼠可能再次或多次跳至銅柵上,受到電擊后又重新跳回平臺,如此訓(xùn)練 3min,并記錄每只大鼠受電擊數(shù)或犯錯次數(shù),以此作為學(xué)習(xí)成績,如此持續(xù) 3d,直至每只鼠的犯錯次數(shù)為 0～ 1。剔除犯錯次數(shù) 2次以上的大鼠,然后根據(jù)學(xué)習(xí)成績將大鼠均分至各實驗組。

1.5 給藥途徑和劑量 實驗動物在行為學(xué)訓(xùn)練和測試結(jié)束后,除對照組外,模型組、實驗組均按每克體重腹腔注射 0.001mg氟哌啶醇注射液,每天 2次,持續(xù) 3d。實驗組在繼續(xù)注射氟哌啶醇的同時,再按每克體重腹腔注射 0.003mL黨參注射液,每天二次,持續(xù) 7d。對照組每天等量腹腔注射生理鹽水,每天二次,持續(xù) 7d。

1.6 組織 SOD、GPX測定 實驗動物注射實驗結(jié)束后,再測試行為學(xué)改變并記錄,隨后斷頸處死。迅速取血及各種組織,血液離心取血清,組織制成 10%勻漿,備用。 SOD、GPX測定,按試劑盒說明書進(jìn)行,蛋白定量采用雙縮目尿法測定。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 所有結(jié)果都用 SPSS12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理,進(jìn)行 ANOV A顯著性分析及 S-N-K和 LSD進(jìn)行組間兩兩比較,文中描述性統(tǒng)計值用平均值±SE,P＜0.05為差異性顯著。

2 結(jié) 果 組織 SOD與 GPX的改變,實驗組與對照組、模型組比較,四種注射液都有不同程度的上調(diào)抗氧化酶的表達(dá) ,在血、海馬和腦皮質(zhì)更為明顯(圖 1、2),但不同的注射液上調(diào)存在差異性。

圖1 對大鼠血及組織 SOD的影響比較

圖2 對大鼠血及組織 GPX的影響比較

討 論 衰老是機(jī)體生物發(fā)育成熟后,機(jī)體的生理功能逐漸下降,組織器官逐步發(fā)生退行性改變,并最終走向衰亡的過程,其機(jī)制復(fù)雜,并與多種因素有關(guān)。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,體內(nèi)自由基的濃度與衰老關(guān)系密切,隨著年齡的增長,抗氧化酶活性不斷下降,體內(nèi)產(chǎn)生的過量氧自由基無法及時清除,造成細(xì)胞代謝和功能形態(tài)的改變 ,致使細(xì)胞衰老。SOD和 GPX作為重要的抗氧化酶系,其表達(dá)變化已成為檢測衰老因素最為敏感和可靠的指標(biāo)[3～4]。根據(jù)氟哌啶醇可使實驗動物產(chǎn)生僵住癥(強(qiáng)直性昏厥,catalepsy)的原理,建立實驗動物快速老化模型,對 SOD和 GPX有抑制作用,是很好的動物老化造模劑[5～6]。本實驗選用了富硒板黨、五鶴續(xù)斷、天麻和頭頂一棵株等四味傳統(tǒng)中藥作為實驗注射液,結(jié)果表明,四種中藥都能顯著上調(diào) SOD和GPX的表達(dá)量,都是有效的抗氧化藥物,但在提高 SOD和GPX的表達(dá)值上還存在明顯的差異性。在血和肝中,天麻的上調(diào)作用最強(qiáng),而在腎、海馬和腦皮質(zhì)中則頭頂一棵株上調(diào)作用最好,在整個上調(diào)表達(dá)上 ,富硒板黨和五鶴續(xù)斷比較均一,提示這四種中藥在不同組織器官作用的靶點(diǎn)可能不一樣的,作用的效果也不一樣,同時也表明不同的中藥材雖然都有抗衰老的作用,但其作用機(jī)理還是存在差異性的,顯然與四種藥材的主要成分不一致是有關(guān)的。作為篩選抗衰老藥物的前期實驗,我們認(rèn)為,不少中草藥都具有抗衰老的作用,但是如何找到最佳的還需要進(jìn)一步的研究,實驗也表明不同的中草藥由于主要成分的差異,作用機(jī)制不同,抗衰老的效果也不一樣,如何弄清是何種成分在起關(guān)鍵作用還有待于研究。

[1] Li H J,Jae H B,Won S E,et al.Transduction of human catalase mediated by an HIV-1 tat protein basic domain and arginine-rich peptides into mammalian cells[J]. Free Radical Biology Medicine.2001,31(11):1509-1519.

[2] 張克烽,張子平,陳 蕓,等.動物抗氧化系統(tǒng)中主要抗氧化酶基因的研究進(jìn)展 [J].動物學(xué)雜志,2007,42(2):153-160.

[3] Moorthy K,SharmaD,BasirS F,et al.Administration of estradiol and progesterone modulate the activities of antioxidantenzyme and aminotransferasesin naturally menopausal rats[J].Exp Gerontol,2005;40(4):295-302.

[4] 劉古鋒,吳偉康,段新芬,等.附子多糖對力竭運(yùn)動小鼠自由基代謝的影響 [J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2008,37(5):529-531.

[5] 黃麗亞.黨參、維生素 C對氟哌啶醇誘導(dǎo)老化大鼠抗氧化酶表達(dá)作用的比較研究[J].陜西中醫(yī),2006,27(12):1584-1586.

[6] 黃麗亞.天麻注射液上調(diào)抗氧化酶表達(dá)作用的實驗研究[J].陜西中醫(yī),2006,27(2):242-243.