孫 靜 錢(qián) 平 嚴(yán)建業(yè) 陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院(咸陽(yáng) 712046)

粉葛為豆科植物甘葛藤 Pueraria thomsonii Benth.的的干燥根,具有解肌退熱,透疹,生津止渴,升陽(yáng)止瀉的功效。葛根的有效部位為其所含的異黃酮類(lèi)物質(zhì),如大豆苷、大豆苷元、葛根素等。其中葛根素(puerarin)是本屬的特有成分,也是主要的有效成分。近年來(lái)國(guó)內(nèi)對(duì)葛根所含化學(xué)成分的藥理作用和臨床應(yīng)用方面的研究不斷增加。研究表明[1],葛根煎劑、浸提劑和總黃酮都有一定的降壓效果。目前葛根異黃酮的提取方法[2]主要有鉛鹽沉淀法,不同濃度的甲醇、乙醇回流和冷浸提取法,水飽和正丁醇冷浸法,水飽和正丁醇萃取—硅膠柱層析等。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際,選擇乙醇回流法提取葛根有效部位,得到科學(xué)合理的工藝參數(shù),為該藥材大生產(chǎn)的應(yīng)用進(jìn)一步奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 調(diào)溫電熱套(型號(hào):ZDHW河北省黃驊市中興儀器有限公司);電子恒溫水浴鍋(型號(hào):GKC-11-CR2上海金橋科析儀器廠);遠(yuǎn)紅外快速恒溫干燥箱(型號(hào):YHG-40×45上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);高效液相色譜儀(Waters 600 Controller,Waters 600Pump);紫外檢測(cè)器(Waters2478Dual λ Absorbance Detector)。

1.2 藥品與試劑 根購(gòu)自西安盛興中藥飲片有限責(zé)任公司(批號(hào):20060330來(lái)源:廣西 ),經(jīng)鑒定為豆科植物甘葛藤的根,習(xí)稱(chēng)粉葛;葛根素化學(xué)對(duì)照品(0752-9907中國(guó)藥品生物制品檢定所);無(wú)水乙醇(洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠)為分析純;水為自制的蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 影響乙醇回流提取效果的因素有乙醇濃度、溶劑用量、回流時(shí)間和提取次數(shù),根據(jù)資料對(duì)每個(gè)因素選取 3個(gè)不同水平,進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選提取工藝,見(jiàn)表 1。

表1 因素水平表

2.2 供試品的制備 將葛根碾成粗粉,稱(chēng)取50g,共 9份,分別置于 1000mL圓底燒瓶中并標(biāo)記,然后按照表 2的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行回流提取,合并提取液并過(guò)濾,濾液回收乙醇,水浴蒸至近干,然后放入烘箱中 80℃干燥 50個(gè) h,可得到深棕色干浸膏。將干浸膏置于干燥器中冷卻至室溫,精密稱(chēng)重。

2.3 葛根素的含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的配制:精密稱(chēng)取葛根素化學(xué)對(duì)照品 0.0112g,用 30%乙醇溶解,定容至 25mL,搖勻。精密移取該溶液 2mL置 10mL容量瓶中并用 30%乙醇定容,最后用 0.45 μm微孔濾膜濾過(guò),搖勻,即得濃度為 0.0896mg/mL葛根素對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的配制:精密稱(chēng)取各干浸膏20mg,用 30%乙醇溶解,定容至 10mL,搖勻,用 0.45 μ m微孔濾膜濾過(guò),標(biāo)記,即得各供試品溶液。

2.3.3 供試品溶液的測(cè)定:色譜條件:Kromasil色譜柱 250×4.6mm,填充劑:十八烷基硅烷鍵和硅膠 ,流動(dòng)相:乙腈 -水 (14∶ 86),流速:1.00mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng):250nm。

精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各 10 μ l,分別注入液相色譜儀,所得結(jié)果如表 3所示。

表3 HPLC測(cè)定數(shù)據(jù)表

2.3.4 測(cè)定數(shù)據(jù)的處理:由已知數(shù)據(jù)可計(jì)算出葛根素對(duì)照品溶液的濃度為 89.6 μ g/mL,利用外標(biāo)法公式[4]計(jì)算出供試品溶液中葛根素的含量。

已知供試品溶液的濃度和供試品溶液中葛根素的濃度,經(jīng)計(jì)算可得出浸膏中葛根素的含量。以所得浸膏重量(x)最高者 5.2625g計(jì) 30分,以浸膏中所含葛根素總量(y)最高者 66.15mg計(jì) 70分,可得綜合評(píng)分(z)=30x/5.2625+70y/66.15。以綜合評(píng)分為(z)指標(biāo)進(jìn)行極差(R)的計(jì)算及方差分析,結(jié)果見(jiàn)表 4、5。

表4 正交實(shí)驗(yàn)表

表5 方差分析表

當(dāng) α=0.05時(shí) ,F α(2,2)=19.00,則 A、 D兩因素的 F值滿(mǎn)足 P{F(2,2)＞ F α(2,2)}=0.05,此二因素三個(gè)水平的變動(dòng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的波動(dòng)影響較大,有顯著性;當(dāng) α=0.01時(shí) ,F α(2,2)=99.00,則只有 A因素的F值滿(mǎn)足 P{F(2,2)＞ F α(2,2)}=0.01,該因素水平的變動(dòng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的波動(dòng)影響非常大,極顯著。

由于正交表上的各列剛好填滿(mǎn),故選取方差來(lái)源中離差平方和最小的一個(gè)近似作為誤差的估計(jì),即SSe≈ SSB=49.85,fe=2。

2.4 結(jié)果 由極差 R的計(jì)算可看出 RA＞RD＞ RC＞ RB,即對(duì)該工藝影響最大的因素是乙醇濃度,其次是提取次數(shù)、回流時(shí)間,溶劑用量影響最小。

由表 4可知最佳提取工藝是 A1B2C2D2。由于經(jīng)方差分析得知 B、C二因素不顯著,所以考慮到生產(chǎn)實(shí)際的需要,可以選用工藝 A1B1C1D2。

2.5 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 將葛根碾成粗粉,稱(chēng)取 50g,共 3份,置于 1000mL圓底燒瓶中并標(biāo)記,然后按照優(yōu)選的 A1B1C1D2工藝條件進(jìn)行回流提取,合并提取液并過(guò)濾,濾液回收乙醇后在 100℃水浴上蒸至近干,然后放入烘箱中 80℃干燥 50個(gè)小時(shí),可得到深棕色干浸膏。將干浸膏置于干燥器中冷卻至室溫,精密稱(chēng)重,所得干浸膏重量分別為:①4.5364g② 4.9525g③4.8367g精密稱(chēng)取各干浸膏 20mg,用 30%乙醇溶解,定容至 10m L,搖勻,用 0.45 μ m微孔濾膜濾過(guò),標(biāo)記即得驗(yàn)證性試驗(yàn)的各供試品溶液。用 HPLC法測(cè)定各供試品溶液中葛根素的含量(色譜條件同前),經(jīng)計(jì)算可得出各浸膏中葛根素的含量:①65.32mg②69.83mg③67.23mg結(jié)果表明采用工藝 A1B1C1D2提取葛根有效部位,效果較好。

3 結(jié) 語(yǔ) 乙醇回流法是提取葛根黃酮的一種經(jīng)典方法,提取效率高,與使用其他有機(jī)溶劑提取相比具有安全環(huán)保、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便易行的特點(diǎn),與水煎煮法相比具有提取物純度較高的優(yōu)點(diǎn),在實(shí)際生產(chǎn)中使用較廣泛。本文通過(guò) L9(34)正交實(shí)驗(yàn)和驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出乙醇回流法提取葛根有效部位的工藝條件,即采用6倍量 70%的乙醇,提取 2次,每次 1h,工藝可行,適合工業(yè)應(yīng)用。

[1] 沈映君.中藥藥理學(xué)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1997:36-38.

[2] 張夢(mèng)軍 ,吳世容,李志良.幾種提取葛根異黃酮的方法比較及實(shí)驗(yàn)優(yōu)化 [J].中成藥,2005,27(10):1133-1135.

[3] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典一部.2005版[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社 ,2005:233-234.

[4] 張廣強(qiáng) ,黃世德.分析化學(xué) (下冊(cè) 儀器分析)[M].北京:學(xué)苑出版社,2001:376.