支文煜

線粒體是生物體內(nèi)能量的主要來(lái)源,因此腦缺血再灌注引起的能量障礙主要與線粒體結(jié)構(gòu)功能損傷有關(guān)。線粒體既是ROS產(chǎn)生的主要細(xì)胞器,也是 ROS主要攻擊對(duì)象。因此清除氧自由基保護(hù)線粒體功能結(jié)構(gòu)完整是發(fā)揮抗腦缺血活性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。

丹參為唇形科多年生草本植物,是我國(guó)傳統(tǒng)活血化淤的中藥,廣泛用于心腦血管疾病的治療,但其作用機(jī)制尚不明確。丹參酮 (Tanshinone)是丹參的有效活性組分,其中丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡA,TanⅡA)為丹參酮中含量最高的活性成分[2]。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,研究丹參酮ⅡA對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷缺血區(qū)額頂部皮質(zhì)線粒體損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物分組 健康 SD大鼠,雄性,清潔級(jí),共 40只,體質(zhì)量 (220±30)g(購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。隨機(jī)分為:假手術(shù)組、缺血再灌注組、TanⅡA低劑量治療組、中、高劑量治療組,每組各 10只。

1.1.2 給藥途徑與藥量 TanⅡA低劑量治療組 (20mg/kg)和高劑量治療組 (40mg/kg)均于術(shù)前連續(xù)灌胃給藥 1周,1次/d,假手術(shù)組和缺血再灌注組給予等量的 0.9%氯化鈉溶液灌胃。第 7天給藥后 1h建立局灶性腦缺血 90min再灌注 24h動(dòng)物模型。

1.1.3 試劑 TTC購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司;Rohdamin123購(gòu)自 sigma公司;線粒體提取試劑盒購(gòu)自海門(mén)碧云天生物工程公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立 參照 Longa等[3]方法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。采用頸外動(dòng)脈插入線栓法,各組均進(jìn)行左側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞。線栓采用石蠟線栓。線栓直徑約0.27mm,插入深度約 18mm,此時(shí)線栓頭位于大腦中動(dòng)脈起始部。缺血 90min時(shí),抽提線栓實(shí)現(xiàn)再灌注。神經(jīng)功能缺陷評(píng)分:按照 Longa等[3]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) (0分:正常,無(wú)神經(jīng)學(xué)征象;1分:動(dòng)物不能完全神展右前肢;2分:動(dòng)物右側(cè)肢體癱瘓,行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈,出現(xiàn)追尾現(xiàn)象;3分:動(dòng)物行走向右側(cè)跌倒,或動(dòng)物不能站立或動(dòng)物打滾;4分:無(wú)自發(fā)活動(dòng),有意識(shí)障礙)各組分別在再灌注 24h進(jìn)行評(píng)分。神經(jīng)功能缺陷評(píng)分在 1～3分為模型成功。

1.2.2 缺血皮質(zhì)線粒體提取 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4],手術(shù)動(dòng)物于缺血再灌注 24h后斷頭取腦,迅速分離右側(cè)大腦前額缺血皮質(zhì),稱重后,置入玻璃勻漿器,按 1∶10(M/V)加入 MSETB緩沖液 (210mm mannitol,70mm sucrose,0.5mm EDTA,10mM Tris-HCl,0.2%BSA,pH7.4),手動(dòng)勻漿,上下各 10次。勻漿液 2000g離心 3min后取上清 12000g再離心 10min。所得沉淀為線粒體。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程在冰面上進(jìn)行。碧云天公司BCA試劑盒蛋白定量[5]。

1.2.3 線粒體呼吸功能檢測(cè)[6-7]采用 Clark-氧電極進(jìn)行測(cè)定,反應(yīng)溫度控制在 30℃。連二亞硫酸鈉標(biāo)定 0%和 100%氧含量。將新鮮制備的線粒體加入到反應(yīng)緩沖液中 (15mm sucrose,25mm Tris-HCl,10mm KH2PO4,pH7.4),加入 5mm呼吸底物蘋(píng)果酸和谷氨酸,最后加入 0.2mM ADP啟動(dòng) 3態(tài)呼吸。3,4態(tài)呼吸速率以及呼吸控制指數(shù)按公式計(jì)算:V=O(nmol)/t(m in)/protein(mg)RCI=V3/V4。

1.2.4 線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物活性檢測(cè) 反復(fù)凍融 3次破壞線粒體膜,測(cè)定溫度 30℃,反應(yīng)體積 1ml。具體方法如下。

1.2.4.1 復(fù)合物Ⅰ活性的測(cè)定 將線粒體與 10mm Tris-HCl(pH8.0)緩沖液、80AM 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decyl-1,4-benzoquinone(DB),1 mg/ml BSA,0.25mm KCN和 0.4AM antimycin(抗霉素 A)混合后,加入 200AM NADH啟動(dòng)反應(yīng)。連續(xù)測(cè)定 340nm處 NADH吸收值的變化 (NADH的消光系數(shù) E=515/mm/cm)。

1.2.4.2 呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅱ活性測(cè)定 將線粒體加入到復(fù)合物Ⅱ反應(yīng)緩沖液內(nèi),混勻后加入 20AM琥珀酸鹽啟動(dòng)反應(yīng)。連續(xù)測(cè)定 600nm處 2,6-dichlorophenol-indophenol(DCPIP)吸收值的變化 (DCPIP的消光系數(shù) E=1911/mM/cm)。反應(yīng)緩沖液含:50mm磷酸鹽 (pH7.4)50AM DCPIP、2mm KCN、2Ag/ml rotenone(魚(yú)藤酮)、 2Ag/ml抗霉素 A、25AM DB。

1.2.4.3 復(fù)合物Ⅲ活性的測(cè)定 將線粒體加入到復(fù)合物Ⅲ反應(yīng)緩沖液內(nèi),混勻后加入 80AM還原型 DB(DBH2)啟動(dòng)反應(yīng)。連續(xù)測(cè)定 550nm處 cytochrome c吸收值的變化 (cytochrome c的消光系數(shù) E=19.0mm/cm)。反應(yīng)緩沖液中含50mm Tris-HCl(pH7.4)、1mm EDTA、250mm蔗糖、2mm KCN、50Am氧化型 cytochrome c。

1.2.4.4 復(fù)合物Ⅳ (細(xì)胞色素氧化酶)活性的測(cè)定 將線粒體加入到復(fù)合物Ⅳ反應(yīng)緩沖液內(nèi),測(cè)定 550nm處 cytochrome c吸收值變化 cytochrome c的消光系數(shù) E=(19.0mm/cm)。緩沖液含 10mm Tris-HCl(pH7.0),25mm蔗糖、120mm KCl、0.025%n-dodecyl-β-D-malto-side、50AM還原型細(xì)胞色素 c(二硫蘇糖醇還原)。

1.2.5 線粒體 ROS檢測(cè)線粒體的 ROS生成量采用 H2DCFDA探針測(cè)定[8]其基本原理是,非熒光性物質(zhì) H2DCFDA能透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞,在細(xì)胞內(nèi)非特異性的內(nèi)源性酯酶作用下脫去乙?；?形成非透膜性物質(zhì) dichlorodihydmfluorescein(H2DCF),后者在 ROS的氧化作用下可生成強(qiáng)熒光性產(chǎn)物 dichloronuorescein(DCF)。測(cè)定方法:取含 40μg蛋白質(zhì)的線粒體孵育于含 10μmol/L H2DCFDA的反應(yīng)緩沖液中加入蘋(píng)果酸和谷氨酸各 2.5mm,一起孵育60m in后以激發(fā)波長(zhǎng)488nm,發(fā)射波長(zhǎng) 525nm,檢測(cè) DCF生成量,以假手術(shù)熒光量為 100%。

1.2.6 線粒體腫脹度的檢測(cè) 新鮮制備線粒體,反應(yīng)緩沖液(250mm蔗糖、5mm KH2PO4、3mm琥珀酸鈉,pH7.2)總體積 150μl,含線粒體蛋白 50μg,混勻后記錄 520nm處吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn),以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA對(duì)缺血再灌注大鼠線粒體呼吸功能的影響腦缺血 1h再灌注 24h可明顯損傷缺血區(qū)線粒體呼吸功能。與假手術(shù)組比較,腦缺血再灌注可導(dǎo)致線粒體呼吸功能各項(xiàng)指標(biāo)明顯改變。3態(tài)呼吸率下降,4態(tài)升高,RCI降低。而丹參酮AⅡ能夠呈劑量依賴性明顯改善線粒體呼吸功能,見(jiàn)圖1。

2.2 丹參酮Ⅱ A對(duì)缺血再灌注大鼠線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物的影響 腦缺血 1h再灌注 24h,可明顯降低線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅳ的活性,假手術(shù)組呼吸鏈酶復(fù)合物 I平均活性為1.81μmol/min/mg protein,缺血再灌注組降至 0.45μmol/min/mg protein;假手術(shù)組Ⅳ平均活性為 0.29μmol/min/mg protein,缺血再灌注組降至 0.15μmol/min/mg protein丹參酮 AⅡ能呈劑量依賴性顯著改善缺血再灌注所導(dǎo)致的線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅳ的下降。對(duì)Ⅱ、Ⅲ無(wú)顯著影響,見(jiàn)圖2。

2.3 丹參酮ⅡA對(duì)缺血再灌注大鼠線粒體 ROS的影響 手術(shù)組線粒體 ROS生成量明顯高于假手術(shù)組,丹參酮 ⅡA能夠顯著降低線粒體 ROS。

2.4 丹參酮 AⅡ?qū)θ毖俟嘧⒋笫缶€粒體腫脹度的影響 線粒體膜腫脹導(dǎo)致其濁度下降,表現(xiàn)為 520nmOD值下降。丹參酮 AⅡ能夠顯著抑制腦缺血再灌注引起的 OD值降低。

圖1 益母草堿對(duì)缺血再灌注大鼠線粒體呼吸功能的影響。A:V 3 3態(tài)呼吸率;B:4態(tài)呼吸率;C:RCI,呼吸控制指數(shù)Figure 1 Effect of TanⅡA on the mitochondrial respiration function of MCAO rats.A:V 3 the activity of state 3 respiration;B:the activity ofstate 4 respiration;C:RCI,respiratory control index

圖2 丹參酮 ⅡA對(duì)缺血再灌注大鼠腦組織線粒體呼吸鏈酶的影響。A:復(fù)合物 I的活性;B:復(fù)合物Ⅱ的活性;C:復(fù)合物Ⅲ的活性;D:復(fù)合物Ⅳ的活性Figure 2 Effectof TanⅡon the enzyme activitiesofm itochondrial respiratory chain in cerebral ischemia-reperfusion ratmodel.A:activity of complexⅠ;B:activity of complexⅡ;C:activity of complexⅢ;D:activity of complexⅣ

圖3 丹參酮ⅡA對(duì)缺血再灌注大鼠腦組織線粒體 ROS的影響Figure 3 Effect of TanⅡA ton ROS generation of mitochondria isolated from the ischemia cortex of MCAO rats

圖4 丹參酮ⅡA對(duì)缺血再灌注大鼠腦組織線粒體腫脹度的影響Figu re 4 Effect of TanⅡon themitochondrial swelling of MCAO rats

3 討論

大量研究表明,線粒體在缺血性卒中發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。線粒體呼吸鏈?zhǔn)怯梢幌盗醒趸€原酶組成,這些酶形成四種主要的電子傳遞酶復(fù)合體,根據(jù)電子傳遞次序分為酶復(fù)合體Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ[8]。

在缺氧缺糖時(shí),線粒體遭受氧自由基的攻擊,功能結(jié)構(gòu)受損,因此呼吸功能出現(xiàn)障礙。我們的研究發(fā)現(xiàn),丹參酮ⅡA能夠呈劑量依賴性地降低缺血再灌注引起 ROS的增多。

3 態(tài)呼吸率是衡量電子沿呼吸鏈傳遞給氧的指標(biāo),4態(tài)主要是傳遞鏈電子漏流所致。3態(tài)和 4態(tài)比值可反映線粒體完整情況[9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò) Clark氧電極,觀察到缺血再灌注后,缺血皮質(zhì)線粒體 3態(tài)呼吸率下降,4態(tài)升高,同時(shí)氧化磷酸化效率降低,表明線粒體內(nèi)膜受損,電子漏流增加。而丹參酮 AⅡ能夠明顯改善這一狀況。

通過(guò)檢測(cè)呼吸鏈酶復(fù)合物發(fā)現(xiàn),復(fù)合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ都明顯降低,但是丹參酮ⅡA只能夠提高 I、IV的活性?？赡苁瞧渥饔冒悬c(diǎn)。

本研究認(rèn)為,缺血再灌注后,線粒體大量自由基的產(chǎn)生,攻擊線粒體,使其結(jié)構(gòu)和功能破壞,酶活性喪失,因?yàn)橐鸷粑δ苷系K,同時(shí)膜屏障的破壞,導(dǎo)致大量離子內(nèi)流,使線粒體腫脹,而丹參酮ⅡA可以阻斷這些途徑。

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2 胡霞敏,周密妹,胡先敏,等.丹參酮ⅡA對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦損傷的保護(hù)作用及對(duì)能量代謝的影響 [J].中國(guó)臨床藥學(xué)雜志,2006,15(3):176-179.

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