劉新,王嵐,劉穎,張曉科

(1.沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院病原生物學研究室,遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)學重點實驗室,遼寧 沈陽 110034;2.解放軍沈陽 202醫(yī)院干診科;3.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院重癥監(jiān)護病房)

現(xiàn)代醫(yī)學技術的發(fā)展,多種侵入性的醫(yī)療器械、生物醫(yī)學材料廣泛應用,如傳統(tǒng)的導尿管、子宮節(jié)育環(huán)、中心靜脈導管、新型的人工心臟瓣膜、各種支架、角膜接觸鏡等,這些器械和材料的應用,在解決了原有醫(yī)療問題的同時,許多引發(fā)了伴生感染 (associated infection)[1],此種現(xiàn)象在有置入性導管者表現(xiàn)尤為突出有研究發(fā)現(xiàn),細菌容易粘附于塑料輸液管內(nèi)表面,形成細菌生物膜 (biofilm),難以沖洗清除[2]。為了解細菌生物膜與置入性導管伴生感染相關性,我們對醫(yī)院實施置入性導管進行檢查或治療的患者撤出導管時進行細菌檢查、分離培養(yǎng)及生物膜形成的研究,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 2009年7月至 2010年6月,采集來自沈陽市多家醫(yī)院病房患者包括導尿管、呼吸機導管及手術的引流管等標本,共 62例 (臨檢已判定有感染,病原菌主要包括銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌及表皮葡萄球菌),無菌操作下,將近人體端 1cm導管外壁 70%酒精涂抹消毒后,縱向剪開,接種環(huán)滅菌刮取內(nèi)壁后接種于 LB肉湯培養(yǎng)基中增菌,37℃過夜,然后用其肉湯分別接種于血平板、麥康凱培養(yǎng)基上,可疑鮑曼不動桿菌轉(zhuǎn)種于青霉素?諾氟沙星培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

1.2 菌種鑒定

1.2.1 初步鑒定 過夜培養(yǎng)的肉湯直接涂片,革蘭染色;平板上可疑菌落觸酶試驗、氧化酶、甘露醇試驗、硝酸鹽還原動力試驗及明膠酶試驗。然后轉(zhuǎn)種相應培養(yǎng)基,純化。

1.2.2 菌種鑒定及生物膜模式株篩選 經(jīng)初步鑒定的菌種,采用生物—梅里埃公司 ATB生化鑒定分析儀,按 ID 32 GN革蘭陰性桿菌鑒定試條(Ref.32 100)、ID 32 STAPH葡萄球菌鑒定試條(Ref.32 500)及 ID 32 C酵母菌鑒定試條 (Ref.32 200)說明書進行鑒定到種。將臨床標本中分離純化的菌株在剛果紅培養(yǎng)基培養(yǎng)[3],產(chǎn)生生物膜的菌株菌落呈深紅色,非模式株菌落為無色。

1.3 生物膜形態(tài)觀察

1.3.1 細菌生物膜染色快速鑒定 根據(jù)文獻[4]配制生物膜染液:阿利新藍 -剛果紅染液:阿利新藍染液:阿利新藍 2g,冰醋酸 3ml,蒸餾水 97m l;剛果紅染液:剛果紅 2g,蒸餾水 100ml。染色方法:接種環(huán)直接刮取導管內(nèi)壁粘液涂于潔凈載玻片上,滴加 10μl阿利新藍染液,混勻,靜置 3～5min,火焰加熱固定,直至染液揮發(fā)完全,滴加 20μl剛果紅染液,均勻涂布,火焰加熱干燥后,三蒸水沖洗,吸干水分后油浸鏡 (NIKON-80I)下觀察。

1.3.2 細菌生物膜形態(tài)結(jié)構觀察 將導管標本分別浸泡于 LB肉湯中,封口膜封口防止污染,Innova40溫控搖床 37℃連續(xù)震蕩培養(yǎng),振幅為 50Hz,每隔 48h取出 PBS沖洗,除去浮游菌,換新培養(yǎng)液,鮑曼不動桿菌持續(xù) 7d,其他菌持續(xù) 5d。振蕩培養(yǎng)后的引流管經(jīng) 2.5%戊二醛 4℃下固定 24h,pH7.2的磷酸鹽緩沖液沖洗 3次,再以 1%的鋨酸4℃固定 2h,4℃雙蒸水沖洗 3次,梯度乙醇脫水(以 50%、70%、80%、90%、95%兩次、100%三次,每次脫水時間 10min),醋酸異戊酯置換,CO2臨界點干燥,離子噴金鍍膜,通過 KYKY-3200 SEM掃描觀察引流管內(nèi)壁生物膜形態(tài)結(jié)構。

1.4 生物膜定量 將剛果紅培養(yǎng)基上菌落為深紅色的菌種,初步確定形成生物膜的模式株,參照文獻[5,6]用微量板進行生物膜定量檢測,96孔板于37℃分別培養(yǎng) 3d后取出,輕輕拍出孔內(nèi)液體,然后用 PBS緩沖液沖洗四次,去除浮游菌。用 1%結(jié)晶紫染色 15min,三蒸水再次沖洗,待孔板晾干后,向每孔內(nèi)加入無水乙醇 -丙酮 (80∶20 v/v)200μl脫色,置于酶標儀 (BioTek ELx800,美國)上測定吸光度 (OD 570 nm)值。

2 結(jié)果

2.1 菌種鑒定 62例導管標本,分離出細菌 137株,其中鮑曼不動桿菌 43例 (31.39%),銅綠假單胞菌 41例 (29.93%),大腸埃希菌 22例(16.05%),葡萄球菌屬 14例 (10.22%),肺炎克雷伯菌 10例,真菌 4例 (4/137,2.92%),其它 7例 (5.11%),有 11例標本有多種細菌混合感染。ATB生化鑒定菌株:鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌的純度達 99.9%。

2.2 生物膜定性 62例臨床標本中有 38例在剛果紅培養(yǎng)基不同程度菌落呈深紅色,為產(chǎn)生生物膜的菌株,陽性率為 61.29%。另 24例菌在剛果紅培養(yǎng)基培養(yǎng),菌落始終為無色。采用阿利新藍-剛果紅涂片染色,生物膜型細菌因胞外多糖被染成深紅色,未成膜的細菌為黃色,背景為藍色。

2.3 細菌生物膜的定量檢測 圖 1表明微量板上生物膜形成,我們發(fā)現(xiàn)顏色最深的孔,恰恰是剛果紅培養(yǎng)基上呈深色菌落的模式株?？莶輻U菌不形成生物膜為陰性對照,幾乎無色。

圖1 微量板上生物膜形成(紫色孔是生物膜形成菌株,顏色越深表明形成的膜越多)

將微量板經(jīng)過酶標儀測定結(jié)果見表1。

表1 細菌生物膜的定量檢測

2.4 掃描電鏡觀察結(jié)果 導管內(nèi)表面有膜狀物質(zhì)形成,膜內(nèi)可見細菌聚集于交聯(lián)的纖維素樣物質(zhì)中 (圖 2 A),由于枯草桿菌無胞外多糖,不能形成生物膜,為陰性對照 (圖 2 B),培養(yǎng) 5d的膜厚度可達 4.92μm(圖 2C)。

圖2 導管內(nèi)細菌生物膜形態(tài)結(jié)構(A導管內(nèi)形成的生物膜,B無生物膜形成的對照組,C培養(yǎng) 5d的膜厚度)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)有感染的患者導管內(nèi)均有細菌檢出,11例患者有多種菌混合感染,病原菌以革蘭陰性桿菌為主 (116/137,84.67%),其中銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌是主要致病菌,這些菌均是臨床耐藥嚴重的菌株。

銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌屬于機會致病菌 ,可引起呼吸道、泌尿生殖道感染及敗血癥等嚴重感染,其中以呼吸道感染最為常見,本研究 62例導管標本中呼吸道感染者 44例 (70.96%),如此高感染率,急需快速檢測方法進行診斷,我們在研究中采用結(jié)晶紫染色方法對細菌生物膜進行定量檢測,阿利新藍染色進行生物膜定位,這些實驗技術簡便快速,可選為臨床快速診斷適宜的方法。掃描電鏡可直接觀察生物膜的形態(tài)特征及結(jié)構,但其實驗環(huán)節(jié)多,技術復雜并要求特殊設備,更適用于研究。

患者有侵入性導管操作時,盡管醫(yī)護人員非常注意無菌技術,但這些患者的醫(yī)院感染率仍然高于其他患者,以往的報告常限于菌群種類和耐藥性分析,而關于這些病原菌如何引起感染少有報道,特別是 ICU患者病情重,各種侵入型導管多,這些導管因與外界相通,為細菌粘附提供了機會。本研究發(fā)現(xiàn)具有較強粘附性的機會致病菌一旦定植于導管,在導管內(nèi)的氣體或液體的流動沖刷下,容易形成生物膜 (38/62,61.29%)。將導管浸入于肉湯培養(yǎng)液中,搖床連續(xù)振蕩,模擬導管液體流動狀態(tài),3天即可形成不易剝離的生物膜,提示這些細菌在醫(yī)用導管內(nèi)定植快,易于形成生物膜,尤其是來源于應用呼吸機通氣的通氣管,鮑曼不動桿菌形成生物膜比率更高,導致 ICU患者呼吸道感染鮑曼不動桿菌呈逐年增多趨勢。鮑曼不動桿菌在自然環(huán)境中普遍存在,具有較強粘附性,屬于條件致病菌,置入性導管高感染率的重要原因可能與細菌導管中快速粘附、定植形成生物膜有關[7],這應引起我們足夠的重視。

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