周 鑫,柴保國(guó),趙衛(wèi)東,鄭振宇,

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南鄭州 450002;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院,河南鄭州 450002)

“DDK綜合癥”(DDK syndrome)是 DDK近交系小鼠的特異繁殖現(xiàn)象,同品系交配或 DDK雄鼠能夠使其它近交系雌鼠正常受孕,但 DDK雌鼠與同亞種內(nèi)其它近交系雄鼠交配時(shí),胚胎在發(fā)育至妊娠 3～5 d因胚泡形成障礙而死亡,導(dǎo)致 DDK雌鼠幾乎不孕[1～3].研究證明,這種極性不育的特性由位于小鼠第 1l條染色體的卵子突變(Ovum Mutant或 Om)位點(diǎn)上的 1對(duì)等位基因所控制[4,5].在小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中,主要表達(dá)的功能基因有原癌基因、生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)發(fā)育及凋亡基因、白細(xì)胞抑制因子等 5大類.其中各個(gè)功能基因表達(dá)量的變化會(huì)對(duì)胚胎的正常發(fā)育造成不同的影響,并且與 Om基因引發(fā)的胚胎致死現(xiàn)象在胚胎學(xué)及生理學(xué)上極為相似,雜交胚胎與本交胚胎在發(fā)育過(guò)程中候選基因片段的表達(dá)差異,可認(rèn)為是直接或間接導(dǎo)致胚胎死亡的因素[6～10].本研究運(yùn)用半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)候選功能基因在表達(dá)水平上檢測(cè)不同交配組合胚胎早期發(fā)育過(guò)程中存在的表達(dá)差異,分析并闡明這些已知基因與 Om基因作用機(jī)理的聯(lián)系,為卵子突變基因作用機(jī)理及卵子突變基因?qū)е碌牟辉邪Y研究提供依據(jù).

表1 候選基因序列及引物Table1 Sequence and primer of candidate gene

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及胚胎

試驗(yàn)所用小鼠為 DDK和 BALB/c品系,每個(gè)品系選 120只,雌雄各 60只.DDK小鼠是從日本理化研究所購(gòu)得,BALB/c小鼠是從河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi),試驗(yàn)小鼠進(jìn)行繁殖擴(kuò)群獲得試驗(yàn)所需樣本.采用正常交配方式,收集不同交配組合(試驗(yàn)組:DDK♀ ×BALB/c♂,對(duì)照組 1:DDK♀×DDK♂,對(duì)照組 2:BALB/c♀×BALB/c♂)小鼠的早期胚胎細(xì)胞,并進(jìn)行觀察,2細(xì)胞期、4細(xì)胞期、8細(xì)胞期受精卵各取 90～110枚.PBS緩沖液沖洗,-70℃保存.

1.2 主要試劑及儀器

RNA提取試劑盒購(gòu)自 TIANGEN公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自 TaKaRa公司;TaqDNA聚合酶(5 U?μL-1);10×PCR緩沖液;MgCl2(25 mmol? L-1);dNTP(每種 10 mmol? L-1);6×電泳上樣緩沖液;Marker(DL2000)(大連寶生物公司);紫外分光光度計(jì)(尤尼柯儀器有限公司);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)基因公司);梯度 PCR儀(Eppendorf公司);UVP凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó) UVP公司).

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

以候選基因在 NCBI中的 cDNA序列為模板,用 Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì),序列見(jiàn)表 1.

以持家基因 β-actin部分序列為模板,用 Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì) 1對(duì)引物,進(jìn)行模板cDNA的質(zhì)量監(jiān)控,退火溫度 56℃,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 316 bp,引物序列為:F:5'-TGGCATCCATGAA ACTACAT-3',R:5'-AACGCAGCTCAGTAACAGTC-3',由 TaKaRa公司(大連)合成.

1.4 候選基因的 RT-PCR檢測(cè)

瞬時(shí)離心混合均勻,放入預(yù)熱至 94℃的 PCR儀中,每個(gè)候選基因的退火溫度如表 1所示.按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取不同時(shí)期胚胎總 RNA及合成 cDNA,以 cDNA為模板,利用相應(yīng)引物 PCR擴(kuò)增目的片段,引物如表 1所示.PCR反應(yīng)體系:50 μL反應(yīng)體積,含 10×PCR buffer(含有 Mg2+)5 μL,2 mmol? L-1d NTP 4.0μL,上下游引物(10 μmol? L-1)各 1.0μL,cDNA 2.5μL和 ExTaqDNA聚合酶(5 U? L-1)0.3μL,DEPC水補(bǔ)足至50μL;擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94℃ 5 min;50℃3 min;72℃ 1 min;1個(gè)循環(huán).94℃ 40 s;退火 40 s(退火溫度見(jiàn)表1);72℃50 s;40個(gè)循環(huán).72℃10 min;4℃保存.擴(kuò)增產(chǎn)物在含 EB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2%瓊脂糖凝膠、0.5×TBE緩沖液,10 V? mL-1電泳 50 min檢測(cè)結(jié)果.采用克隆測(cè)序法,將鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒送到 TIANGEN公司測(cè)序,確定擴(kuò)增片段的序列.使用 DNAMan軟件中的序列相似性分析功能,比較所獲得的擴(kuò)增片段,檢查每一個(gè)擴(kuò)增片段的 2到 5個(gè)陽(yáng)性克隆的測(cè)序結(jié)果是否一致,確定擴(kuò)增基因片段的準(zhǔn)確性.

1.5 半定量分析候選基因的表達(dá)情況

同一份樣本中分別取 20μL候選基因的擴(kuò)增產(chǎn)物和 β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物,DNA marker 3μL,用質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2%瓊脂糖凝膠電泳檢查,在凝膠成像分析系統(tǒng)(UVP)上攝像,并對(duì)電泳條帶利用圖像分析系統(tǒng) Glyko BandScan 5.0進(jìn)行灰度分析,以候選基因擴(kuò)增產(chǎn)物與相應(yīng)的 β-actin產(chǎn)物的 LOD的比值來(lái)表示候選基因 mRNA的相對(duì)含量.

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用 SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析,數(shù)據(jù)用來(lái)表示 .

2 結(jié)果與分析

2.1 不同交配組合早期胚胎的采集

從不同孕期的懷孕雌鼠中獲得不同時(shí)期的早期胚胎,選擇發(fā)育良好、形態(tài)正常的胚胎進(jìn)行試驗(yàn).一般形態(tài)正常的 2細(xì)胞期胚胎有 1個(gè)清晰可見(jiàn)的極體,或已經(jīng)將極體完全排除,質(zhì)地均勻.發(fā)育良好、形態(tài)正常的分裂期胚胎顯示各階段特異性的細(xì)胞分割,具有相等大小的分裂球,無(wú)細(xì)胞質(zhì)碎片.通過(guò)對(duì)不同交配組合早期胚胎細(xì)胞的觀察,2組對(duì)照組交配方式的胚胎能夠在 2細(xì)胞期之后繼續(xù)正常發(fā)育.但是,試驗(yàn)組交配組合的胚胎細(xì)胞在發(fā)育至8細(xì)胞期后即桑葚期開(kāi)始,出現(xiàn)大量凋亡現(xiàn)象,胚胎細(xì)胞核質(zhì)彌散,確定為死亡胚胎細(xì)胞,無(wú)法進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn).因此,胚胎細(xì)胞的采集以發(fā)育正常的 2細(xì)胞期、4細(xì)胞期及 8細(xì)胞期胚胎細(xì)胞為主要對(duì)象.分別采集不同交配組合中 3個(gè)時(shí)期的胚胎細(xì)胞進(jìn)行研究.

2.2 候選基因的 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2.1 β-actin檢測(cè)結(jié)果 胚胎總 RNA反轉(zhuǎn)錄為第 1鏈 cDNA后,用內(nèi)參照 β-actin(管家基因)引物進(jìn)行擴(kuò)增,通過(guò)產(chǎn)物電泳分析,可見(jiàn)明顯的 316 bp的片段,說(shuō)明 RNA反轉(zhuǎn)錄效果較好(圖 1).2細(xì)胞期、4細(xì)胞期、8細(xì)胞期 β-actin的表達(dá)量在試驗(yàn)組與對(duì)照組胚胎中基本相同,說(shuō)明 2種交配組合反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物濃度基本一致,可以進(jìn)行候選基因差異表達(dá)研究.

圖1 小鼠早期胚胎 2細(xì)胞,4細(xì)胞,8細(xì)胞 cDNA檢測(cè)結(jié)果Fig.1 cDNA of early embryo of mice examined 2-cell,4-cell,8-cell embryo by agarose eletrophoresis

2.2.2 2細(xì)胞期候選基因的 RT-PCR擴(kuò)增 候選基因在 2細(xì)胞期胚胎中的擴(kuò)增產(chǎn)物,利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳(圖 2).結(jié)果表明,在 3種交配組合中只檢測(cè)到 EGF,Bcl-2,Mcl-1的表達(dá),而其他 5個(gè)候選基因都未檢測(cè)到表達(dá).由于 2細(xì)胞期是小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中,母型調(diào)控向合子型調(diào)控的過(guò)渡階段,胚胎合子基因組未完全激活.因此,檢測(cè)到的候選基因表達(dá)量較低,電泳條帶較弱.

2.2.3 4細(xì)胞期候選基因的 RT-PCR擴(kuò)增 候選基因在 4細(xì)胞胚胎中的擴(kuò)增產(chǎn)物,利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳(圖 3).結(jié)果表明在 3種交配組合中共檢測(cè) 6個(gè)候選基因表達(dá),且表達(dá)量較高.由于 4細(xì)胞期小鼠胚胎中合子基因組已經(jīng)激活,因此擴(kuò)增條帶明顯.另外,檢測(cè)到的候選基因中H-ras,C-myc在 3種交配組合胚胎細(xì)胞中擴(kuò)增條帶亮度相同;而 EGF,EGF-R,Bcl-2,Mcl-1在試驗(yàn)組組合中擴(kuò)增條帶亮度弱于對(duì)照組,說(shuō)明這些候選基因在試驗(yàn)組胚胎中表達(dá)被抑制.

2.2.4 8細(xì)胞期候選基因的 RT-PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果 候選基因在 8細(xì)胞胚胎中的擴(kuò)增產(chǎn)物,利用質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳(圖 4).其結(jié)果與4細(xì)胞期相似,在 3種交配組合中仍未檢測(cè)到 LIF,但是檢測(cè)到 TGF-α的表達(dá),候選基因擴(kuò)增條帶明顯,并且個(gè)別候選基因表達(dá)量上較 4細(xì)胞期有明顯提高.其中 TGF-α,C-myc,H-ras在 3種交配組合胚胎細(xì)胞中擴(kuò)增條帶亮度相同;而 EGF,EGF-R,Bcl-2,Mcl-1在試驗(yàn)組組合中擴(kuò)增條帶亮度弱于對(duì)照組,說(shuō)明這些候選基因在試驗(yàn)組胚胎中表達(dá)量較低.

2.2.5 擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果 將擴(kuò)增條帶回收后送到 TIANGEN公司測(cè)序.對(duì)測(cè)序差異表達(dá)片段信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(略).結(jié)果表明,擴(kuò)增片段序列與GenBank公布的候選基因 cDNA序列相比,各個(gè)基因擴(kuò)增結(jié)果較好,同源性達(dá) 97% ～99%,證明所擴(kuò)增的片段是候選基因片段.

2.2.6 候選基因的半定量分析 將凝膠成像圖片用 BandScan 5.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)候選基因與 βactin電泳結(jié)果進(jìn)行灰度對(duì)比分析(每個(gè)樣本重復(fù) 3次),從而顯示不同時(shí)期候選基因在小鼠胚胎中的mRNA豐度,2細(xì)胞期、4細(xì)胞期、8細(xì)胞期結(jié)果分別見(jiàn)表 2～表 4.

從表 2可以看出,候選基因小鼠的 2細(xì)胞期胚胎中的表達(dá)存在差異.EGF,Bcl-2,Mcl-1 3種候選基因在試驗(yàn)組 2細(xì)胞期胚胎中表達(dá)量分別與對(duì)照組 2細(xì)胞期胚胎中表達(dá)量差異顯著(P＜0.05),并且在試驗(yàn)組中表達(dá)量明顯低于 2個(gè)對(duì)照組.

從表 3可以看出,在 3種交配組合小鼠 4細(xì)胞期胚胎中檢測(cè)到 6個(gè)候選基因,其中部分候選基因的表達(dá)存在差異.C-myc,H-ras在 4細(xì)胞期小鼠胚胎細(xì)胞中表達(dá)差異不顯著(P＞0.05);而 EGF,EGF-R,Bcl-2,Mcl-1在 3種交配組合 4細(xì)胞期胚胎中表達(dá)差異顯著(P＜0.05),并且在試驗(yàn)組中表達(dá)量明顯低于 2組對(duì)照組.

圖4 8細(xì)胞期候選基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Results of 8-cell RT-PCR amplification

表2 2細(xì)胞期候選基因在 3種交配組合小鼠胚胎中的 mRNA豐度Table2 Relative contents of candidate gene in 2-cell embryo

表3 4細(xì)胞期候選基因在 3種交配組合小鼠胚胎中的 mRNA豐度Table3 Relative contents of candidate gene in 4-cell embryo

表4 8細(xì)胞期候選基因在 3種交配組合小鼠胚胎中的 mRNA豐度Table4 Relative contents of candidate gene in 8-cell embryo

從表 4可以看出,在 3種交配組合小鼠 8細(xì)胞期胚胎中檢測(cè)到 7個(gè)候選基因,其中與 4細(xì)胞期檢測(cè)相同的 6個(gè)候選基因,在表達(dá)上的差異也相同.TGF-α,C-myc,H-ras在 8細(xì)胞期小鼠胚胎細(xì)胞中表達(dá)差異不顯著(P＞0.05);而 EGF,EGF-R,Bcl-2,Mcl-1在 3種交配組合 8細(xì)胞期胚胎中表達(dá)量差異顯著(P＜0.05),并且在試驗(yàn)組中表達(dá)量明顯低于 2個(gè)對(duì)照組.

3 小結(jié)與討論

1)基于對(duì) Om基因研究的相關(guān)結(jié)論分析,Om基因可能是通過(guò)母源 RNA分子影響其它早期胚胎發(fā)育的功能基因,通過(guò)對(duì) DNA(2細(xì)胞期精卵基因組發(fā)生融合)水平進(jìn)行的直接修飾或?qū)δ芑騌NA水平(成熟 mRNA形成過(guò)程中)的間接修飾,使其不能正常表達(dá)或者不能正常作用于胚胎發(fā)育,進(jìn)而導(dǎo)致胚胎致死[7].小鼠作為高等哺乳動(dòng)物,其基因調(diào)控具有復(fù)雜性,致死性狀的產(chǎn)生極有可能是由多基因調(diào)控的.本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中功能基因的篩選分析確定一系列候選基因,這些功能基因均在胚胎發(fā)育早期表達(dá),并且其表達(dá)情況直接影響胚胎的正常發(fā)育.通過(guò)對(duì)胚胎學(xué)及形態(tài)學(xué)的分析,這些候選基因的異常表達(dá)能夠?qū)е屡咛ブ滤?并且與 Om基因介導(dǎo)的胚胎致死現(xiàn)象極為相似.

2)EGF和 EGF-R基因?qū)儆谏L(zhǎng)因子,體細(xì)胞的生長(zhǎng)分化由生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)是早已明確證實(shí)的[10],而在早期胚胎發(fā)育方面,生長(zhǎng)因子可能的作用尚不清楚.小鼠胚胎中,從 4細(xì)胞期開(kāi)始就可測(cè)到 EGF-RmRNA,EGF主要通過(guò)自分泌或旁分泌的方式作用于胚胎中的EGF-R,調(diào)節(jié)胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育[11].不同發(fā)育時(shí)期的小鼠植前胚胎受 EGF的作用也有差異,在 4細(xì)胞期前促進(jìn)卵裂,桑葚胚期以后表現(xiàn)為調(diào)節(jié)分化.在含有 EGF的培養(yǎng)基中能顯著提高囊胚孵化率,且特定濃度的 EGF對(duì)胚胎早期發(fā)育、著床均起到一定的作用[9].試驗(yàn)證明,EGF,EGF-R在早期胚胎發(fā)育、胚胎的分化與增生、胚泡附植等過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[11～15].TGF-α通過(guò)與 EGF共同的受體即 EGF-R,對(duì)哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育也具有重要的作用.在體外培養(yǎng)液中添加 TGF-α,則小鼠胚胎 mRNA轉(zhuǎn)錄加快,蛋白質(zhì)合成增加,細(xì)胞數(shù)量增多,胚胎發(fā)育速度加快.嚴(yán)云勤等[12]通過(guò) RT-PCR技術(shù)檢測(cè)小鼠早期胚胎中 TGF-α的 mRNA表達(dá),發(fā)現(xiàn) TGF-α在囊胚期作用較大,可能與囊胚腔的形成和擴(kuò)展有關(guān).

3)Bcl-2和 Mcl-1同屬于凋亡基因[9].HARDY[11]在形態(tài)正常的人類囊胚中檢測(cè)到了 Bcl-2的高表達(dá),而在同期碎裂胚胎當(dāng)中則沒(méi)有發(fā)現(xiàn).李威等[14]利用巢式 PCR方法檢測(cè)小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中 Bcl-2家族基因的表達(dá)情況,及其與胚胎細(xì)胞凋亡的關(guān)系.Bcl-2的高表達(dá)通常被認(rèn)為能夠抑制細(xì)胞的凋亡,它的表達(dá)量的升高導(dǎo)致胚胎細(xì)胞凋亡比率的降低.隨著胚胎發(fā)育進(jìn)程,胚胎細(xì)胞數(shù)量不斷增多,胚胎總體處于快速增殖時(shí)期,Bcl-2的表達(dá)不斷增加有利于胚胎生長(zhǎng)和發(fā)育.

4)在對(duì)候選基因的檢測(cè)過(guò)程中,發(fā)現(xiàn) 3種交配方式小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中都沒(méi)有檢測(cè)到LIF的表達(dá),在胚胎發(fā)育過(guò)程中 LIF可能是通過(guò)母體子宮或者卵巢分泌機(jī)制產(chǎn)生進(jìn)一步作用于胚胎,而早期胚胎細(xì)胞本身不產(chǎn)生 LIF.

5)本試驗(yàn)利用半定量 RT-PCR技術(shù),通過(guò)對(duì)(DDK♀ ×BALB/c♂),(DDK♀ ×DDK♂),(BALB/c♀×BALB/c♂)3組交配組合小鼠早期胚胎細(xì)胞中候選基因表達(dá)量差異的檢測(cè),證實(shí)了Om基因控制的卵子細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)以某種機(jī)制作用于 Mcl-1,Bcl-2,EGF和 EGF-R,并通過(guò)這些基因表達(dá)水平的降低間接地引發(fā)早期胚胎致死現(xiàn)象.

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