胡楓江,姬少龍,趙媛媛,閆萬峰,江 敏,胡建東

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)機電工程學(xué)院,河南鄭州 450002;2.河南農(nóng)大迅捷測試技術(shù)有限公司,河南鄭州 450002;3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南鄭州 450002)

光學(xué)表面等離子共振(Surface plasomon resonance,SPR)生物傳感技術(shù)以其實時監(jiān)測、無需標(biāo)記、非破壞性探測和耗樣量少等特點在農(nóng)業(yè)、食品安全監(jiān)測、藥物篩選、臨床醫(yī)學(xué)及環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域得到越來越廣泛的應(yīng)用[1～3].研究人員就構(gòu)建光學(xué)表面等離子共振生物傳感器的光源、光學(xué)掃描機構(gòu)、芯片系統(tǒng)、微流通池裝置、光電信號檢測等方面進行了研究,相繼研發(fā)了不同類型的光學(xué) SPR生物分析儀[4].但這些儀器體積大,攜帶不便,價格昂貴,阻礙了光學(xué) SPR生物分析儀的推廣使用[5].隨著中國生物分析技術(shù)的發(fā)展,對高通量、非破壞和無需要標(biāo)記的便攜式光學(xué) SPR生物分析儀的需求日益迫切,急需要研究出低成本、非掃描式的光學(xué) SPR生物分析儀.光學(xué) SPR生物分析儀可分為棱鏡型、光柵型、光波導(dǎo)型和光纖型等結(jié)構(gòu),光學(xué)SPR光譜信號調(diào)制方式又有波長調(diào)制型、角度調(diào)制型、相位調(diào)制型和強度調(diào)制型等[6～10].目前,低成本的光學(xué) SPR生物傳感器有些選擇發(fā)光二極管(LED)為光源,克服了光學(xué)干涉所產(chǎn)生的影響,但LED光源線寬大,光穩(wěn)定性隨電源電壓波動強,光強弱,所獲得的光學(xué) SPR共振圖像不夠清晰,光電信號處理困難和檢測系統(tǒng)成本高.作者設(shè)計的一字線型激光器式光學(xué)生物傳感器使光學(xué) SPR生物分析儀小型化、低成本,可獲得高質(zhì)量,重復(fù)性好的響應(yīng)結(jié)果,可提高生物樣本的分析效率.

圖1 光學(xué)SPR生物傳感器結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 A schematic structure of an optical SPR biosensor

1 一字線型激光器式光學(xué)生物傳感器設(shè)計原理

一字線型激光器式光學(xué) SPR生物傳感器主要由光源、光學(xué) SPR芯片和 CCD光電檢測器 3部分組成.光源由一字線型激光器(波長 650 nm)和光學(xué)偏振片組成,光學(xué) SPR芯片由表面蒸鍍有 50 nm金膜的光學(xué)直角棱鏡和微流通池組成,CCD光電檢測器由 1 024個像素的線陣 CCD和數(shù)據(jù)采集器組成(圖 1).一字線型激光器式光學(xué)生物傳感器為非掃描性等效于角度調(diào)制型光學(xué) SPR生物傳感器,固定激光器和入射波長,將一字線型激光器發(fā)出的激光光束以一定角度穿過直角棱鏡入射到棱鏡與金膜的界面,光線從該界面產(chǎn)生全反射,線陣CCD收集從棱鏡反射回來的光強信號,經(jīng)過 A/D轉(zhuǎn)換后通過 RS232接口傳給上位機,上位機實時顯示采集到的數(shù)據(jù)并通過動力學(xué)分析獲得光學(xué)SPR共振曲線.分析反射光信號強度最低點在線陣CCD上的像素位置或?qū)?yīng)的光學(xué)響應(yīng)值與被測樣品折射率之間的關(guān)系,從而獲得待測樣品的折射率值,樣品的折射率值與附著在芯片表面的物質(zhì)量相關(guān),檢測折射率的值就可以獲得被測物的濃度值,合適的入射光的角度,可以得到分辨率為1×10-6RIU.

通過對多種型號的激光器進行試驗篩選,選擇型號為 ST650UL5G,波長為(650±5)nm的一線激光器(直徑 16 mm×45 mm),它的光線質(zhì)量相對較好,光斑 50～100 mm,線寬 3 mm,線長度 10～20 mm,激光光束經(jīng)透鏡后的輸出光線張角為 10°～135°.選擇BK7等腰直角三角棱鏡,等腰直角三角棱鏡容易固定,可縮短光路,便于小型化,棱鏡端面鍍有 50 nm厚的金膜,此傳感器中的光學(xué) SPR生物芯片具有可更換性.光學(xué)SPR生物分析儀的重要組成部件是光學(xué) SPR生物傳感器,而其光學(xué) SPR生物芯片的制造成本和生物芯片的可更換性是其關(guān)鍵.在直角三角型棱鏡端面蒸鍍 50 nm金膜,可提供一種制備方便和成本低廉的快速更換生物芯片的分析體系.微流通池采用塑料基底,通道的進出管路為不銹鋼管,整個傳感器處于恒溫控制系統(tǒng)內(nèi),設(shè)定的控制溫度為 25℃,每個微流通池裝置設(shè) 3個通道,可同時檢測 3種被測樣品或者 1個通道設(shè)置為參考通道,用于實測樣品時作標(biāo)準(zhǔn)光路用.每個通道長 100 mm、寬 1 000μm、直徑為 500μm.圖1中的一字線型激光器光束,經(jīng)過偏振片后產(chǎn)生 P偏振光,入射進入等腰直角棱鏡,在棱鏡端面形成一條平直光線.試驗時,直角棱鏡端面(金膜表面)上壓上微流通池,其通道與金膜的長邊平行,使微流通池的通道完全覆蓋入射光在棱鏡端面形成的平直光線.全反射后光線照射到 CCD上時形成直線型光斑,當(dāng)微流通池中通有待測液體時,由于光學(xué) SPR現(xiàn)象,必然有某一角度的入射光線在棱鏡端面產(chǎn)生表面等離子波共振,形成光學(xué) SPR共振吸收峰,根據(jù)CCD檢測到的不同像素位置的光響應(yīng)值,可間接獲得由像素位置表示的光學(xué)SPR共振角度.

2 材料與方法

2.1 乙醇溶液的配置

配制體積分?jǐn)?shù)分別為 0.13,0.14,0.15,0.16,0.17,0.18,0.19的 10.00 mL系列乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液.

2.2 棱鏡端面的金膜清洗

將帶有金膜的棱鏡置于體積分?jǐn)?shù)為 4%的SDS溶液中,用超聲波清洗約 30 min后取出,用去離子水沖洗金膜表面,再用 N2吹干備用.

2.3 試驗方法

試驗采用的試劑為去離子水和不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇,把試驗平臺放置于暗箱中,減小外來光線和電磁信號干擾.試驗步驟如下:(1)固定一字線型激光器、CCD及驅(qū)動器,使入射至每個像素位置的入射光束和反射光束的光程相加相等,用滴管吸取少量的去離子水或乙醇溶液滴在棱鏡端面的金膜上,盡可能地完全覆蓋金膜.(2)旋轉(zhuǎn)調(diào)整激光器,使激光光束通過全反射后照到 CCD表面,此時通過上位機觀察獲得光學(xué) SPR共振響應(yīng)曲線.(3)觀察光學(xué) SPR曲線是否出現(xiàn)最低點,即要尋找共振角,如無則繼續(xù)調(diào)整激光器或 CCD的位置,直至獲得理想的光學(xué) SPR共振曲線為止.通過對不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液的試驗來驗證光學(xué)表面等離子生物傳感器的靈敏度,靈敏度反映單位體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液產(chǎn)生的光學(xué)響應(yīng)最低值大小.

首先用去離子水確定基線,待基線穩(wěn)定后,依次滴入微流通池體積分?jǐn)?shù)為 0.13,0.14,0.15,0.16,0.17,0.18,0.19的乙醇溶液分別試驗,觀察上位機上的光學(xué) SPR共振曲線,待每個體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液滴加至微流通池至信號穩(wěn)定再讀數(shù),其中每完成1個體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液測定后均用去離子水沖洗金膜表面進行再生,使傳感器能夠連續(xù)測量.

3 傳感器性能測試

按照上述的試驗方法,首先獲得除離子水的光學(xué) SPR共振曲線,圖 2是直接由數(shù)據(jù)采集器獲得的去離子水原始數(shù)據(jù),其中光學(xué)響應(yīng)值是 CCD檢測到不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液的電壓與空氣背景電壓的相對值,由于光學(xué)傳感器的密閉不嚴(yán),或CCD受溫度影響出現(xiàn)曲線不平滑,通過數(shù)據(jù)平滑處理后獲得的去離子水光學(xué) SPR共振曲線如圖 3所示,此處采用的濾波方法是取某一像素點前后各10個數(shù)據(jù)進行平均作為該點值,濾除了檢測系統(tǒng)的噪聲值.

按照去離子水的試驗方法,依次進行體積分?jǐn)?shù)為 0.13,0.14,0.15,0.16,0.17,0.18,0.19乙醇溶液的光學(xué) SPR共振曲線試驗,結(jié)果見圖 4.

圖 4中的不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液光學(xué) SPR共振曲線是經(jīng)過平滑濾波后獲得的,可見不同的體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液,其光學(xué)響應(yīng)最低值是不同的,分別依次為 290,279,253,250,237,236,231.為了分析一字線型光學(xué) SPR生物傳感器的靈敏度,建立不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液所對應(yīng)的光學(xué)響應(yīng)最低值關(guān)系,如圖 5所示.隨著乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)的增加,光學(xué)響應(yīng)最低值減小.

一字線型激光器式光學(xué)生物傳感器的靈敏度是指被測乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的變化相對于光學(xué)響應(yīng)最低值的變化,靈敏度分析可以驗證一字線型激光式生物光學(xué)生物傳感器的使用性能,也反映該光學(xué) SPR芯片的敏感度.光學(xué)響應(yīng)最低點的值(OP)隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)(V)的增加而減小,二者之間存在線性關(guān)系,擬合直線為 OP=418.86-1 025V,其相關(guān)系數(shù)為 -0.970 5,檢測靈敏度為 1.025×103.

圖4 體積分?jǐn)?shù)分別為 0.13(a),0.14(b),0.15(c),0.16(d),0.17(e),0.18(f),0.19(g)的乙醇溶液光學(xué)SPR共振響應(yīng)曲線Fig.4 The optical SPR responsecurve of ethanol at volume fraction 0.13(a),0.14(b),0.15(c),0.16(d),0.17(e),0.18(f),0.19(g)respectively

圖5 乙醇溶液光學(xué)響應(yīng)最低值與其體積分?jǐn)?shù)之間的關(guān)系曲線Fig.5 The optical resonance dip-value as a function of ethanol volume fraction

4 結(jié)論

一字線型激光器式光學(xué)生物傳感器,減少了角度調(diào)制的可動部件,解決了由于角度動態(tài)調(diào)整而產(chǎn)生的噪聲,提高了光學(xué) SPR生物傳感器的穩(wěn)定性.傳統(tǒng)的光學(xué) SPR生物傳感器的芯片為玻璃片表面蒸鍍金膜結(jié)構(gòu),使用時將鍍有金膜的玻璃片貼至棱鏡端面構(gòu)成光學(xué) SPR生物傳感器,鍍有金膜的玻璃片與棱鏡端面的貼合要求致密無空氣間隙,調(diào)試費工費時.本研究提出了光學(xué)棱鏡端面蒸鍍金膜的光學(xué) SPR芯片結(jié)構(gòu),可以實現(xiàn)光學(xué) SPR生物傳感器的芯片快速更換,與傳統(tǒng)的光學(xué) SPR生物傳感器相比大大降低了制造成本.通過對不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液試驗,結(jié)果表明,一字線型光學(xué) SPR生物傳感器的靈敏度為 1.025×103,一字線型激光器式光學(xué)生物傳感器結(jié)構(gòu)緊湊、性價比高,由此構(gòu)成的光學(xué) SPR生物分析儀具有良好的推廣使用前景.

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