(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京鼓樓醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇南京 210008)

腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是治療終末期腎臟病的主要方法，然而腹膜透析液(peritoneal dialysis solutions，PDS)中的高糖、低pH值及反復(fù)發(fā)生的腹膜炎介導(dǎo)的腹膜纖維化導(dǎo)致腹膜結(jié)構(gòu)改變和功能喪失是長(zhǎng)期PD患者退出PD的主要原因。研究表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)分泌增加是腹膜纖維化發(fā)生發(fā)展的重要因素。許多實(shí)驗(yàn)研究證明，中藥丹參酮ⅡA(tanshinoneⅡA)可以拮抗多種因素對(duì)細(xì)胞造成的損傷作用，減輕纖維化［1－2］。我們通過(guò)觀察丹參酮ⅡA對(duì)葡萄糖PDS干預(yù)下的大鼠腹膜組織學(xué)變化以及TGF-β1表達(dá)的影響，探討丹參酮ⅡA是否具有抑制TGF-β1的表達(dá)從而發(fā)揮抗腹膜纖維化作用。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SD(Sprague-Dawley)大鼠50只，雄性，清潔級(jí)，體重180～220 g，周齡6～8周(南京大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，于清潔級(jí)動(dòng)物籠內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)，給予清潔級(jí)大鼠飼料及自由飲水。50只大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只:對(duì)照組，每日用生理鹽水腹腔注射20 ml;PDS組，每日用4．25%的PDS腹腔注射20 ml;丹參酮低、中、高濃度組，每日分別用含丹參酮ⅡA 濃度為 50、100、200 mg·L－1的4．25%的 PDS 腹腔注射20 ml。于實(shí)驗(yàn)第30天，注射上述藥物2 h后氯胺酮(3 ml·kg－1)肌肉注射麻醉，打開腹腔取壁層腹膜組織置于10%中性緩沖甲醛中，斷頸處死大鼠。

1．2 藥物、主要試劑和儀器

4．5%Baxter PDS為廣州百特醫(yī)療用品公司產(chǎn)品，丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液為江蘇科菲平醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品，規(guī)格10 mg·支－1。兔抗大鼠 TGF-β1多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，二步法免疫組化檢測(cè)試劑(PV-6001)購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1．3 腹膜組織學(xué)檢查

取石蠟包埋的壁層腹膜組織，作2 μm切片，60℃烘干融蠟，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化并經(jīng)蒸餾水充分漂洗，常規(guī)方法HE、Masson染色，光鏡下觀察病理改變。壁層腹膜厚度測(cè)量，選用HE染色切片200倍光學(xué)顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野分5處測(cè)量，取其平均值作為腹膜厚度值。壁層腹膜Masson染色切片，200倍光學(xué)顯微鏡下觀察膠原纖維分布，以藍(lán)綠色為陽(yáng)性信號(hào)，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野攝片，經(jīng)Image-Pro Plus 5．0圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Media Cybernetics公司)采集圖像，分析其陽(yáng)性信號(hào)的平均積分光密度(integrated OD total，IOD)，取平均值。

1．4 TGF-β1的表達(dá)

用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定。取石蠟包埋的壁層腹膜組織，作2 μm切片。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化并經(jīng)蒸餾水充分漂洗后置于1 mmol·L－1的EDTA(pH 8．0)緩沖液中電磁爐加高壓鍋方法高溫高壓熱修復(fù)2 min。PBS緩沖液漂洗后滴加3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，孵育10 min，PBS緩沖液中漂洗3 min×3 次，吸干后滴加 100 μl兔抗大鼠 TGF-β1多克隆抗體(1∶800)，4℃冰箱孵育過(guò)夜，PBS緩沖液漂洗3 min×3次，再滴加100 μl二步法免疫組化檢測(cè)試劑，室溫下孵育30 min，再次PBS緩沖液漂洗3 min×3次。DAB顯色，光鏡控制，蒸餾水漂洗，復(fù)染及封片。陰性對(duì)照用PBS緩沖液代替一抗。每張切片在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察顯色結(jié)果，棕褐色顆粒為陽(yáng)性信號(hào)，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野攝片，經(jīng)Image-Pro Plus 5．0圖像分析系統(tǒng)分析其陽(yáng)性信號(hào)的IOD值，取平均值。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異比較采用SPSS 13．0軟件進(jìn)行方差分析檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 各組大鼠腹膜組織學(xué)觀察

HE染色顯示對(duì)照組大鼠腹膜較薄，間皮細(xì)胞完好，間皮下基底膜薄，并與結(jié)締組織相連，間皮下膠原纖維無(wú)明顯沉積。PDS組大鼠腹膜明顯增厚，間皮細(xì)胞脫落，腹膜間皮下基質(zhì)明顯增多，膠原纖維大量沉積。丹參酮組大鼠腹膜也有增厚，間皮細(xì)胞也有脫落，間皮下基質(zhì)增多，膠原纖維沉積，程度比PDS組略輕(圖1)。各組壁層腹膜致密層厚度比較見表1，其中PDS組腹膜增厚程度最明顯(P＜0．01);丹參酮低濃度組與丹參酮中、高濃度組相比，具有顯著差異(P＜0．01);丹參酮高濃度組與丹參酮中濃度組相比，具有顯著差異(P ＜0．01)。

圖1 各組大鼠壁層腹膜組織學(xué)觀察 HE染色×200Fig 1 Morphology changes of parietal peritoneum from rats HE staining，Magnification×200

表1 各組壁層腹膜致密層厚度比較Tab 1 Submesothelial compact zone thickness of parietal peritoneum from rats

Masson染色顯示PDS組膠原纖維的陽(yáng)性染色主要分布在腹膜間皮下間質(zhì)，較對(duì)照組陽(yáng)性染色明顯增多(圖2)。膠原纖維分布的半定量分析結(jié)果見表2。PDS組壁層腹膜膠原纖維含量明顯高于其他各組(P＜0．01)。丹參酮中、高濃度組較丹參酮低濃度組膠原含量均明顯減少(P＜0．05);丹參酮中濃度組較丹參酮高濃度組膠原纖維含量明顯增加(P＜0．05)。

圖2 各組大鼠壁層腹膜組織學(xué)觀察 Masson染色×200Fig 2 Morphology changes of parietal peritoneum from rats Masson staining，Magnification×200

表2 各組大鼠壁層腹膜膠原纖維分布的半定量分析Tab 2 Semiquantitative analysis of submesothelial matrix of parietal peritoneum from rats

2．2 各組大鼠壁層腹膜組織中TGF-β1分布觀察及半定量分析結(jié)果

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)顯示，TGF-β1的陽(yáng)性染色(棕褐色)主要分布在腹膜間皮細(xì)胞胞漿(圖3)。TGF-β1表達(dá)半定量分析結(jié)果見表3。與PDS組壁層腹膜比較，對(duì)照組 TGF-β1表達(dá)量顯著減少(P＜0．01)，丹參酮組明顯減少(P ＜0．01)。丹參酮中、高濃度組較丹參酮低濃度組TGF-β1表達(dá)量明顯減少(P＜0．01)，丹參酮高濃度組較中濃度組TGF-β1表達(dá)量明顯下降(P ＜0．05)。

圖3 各組大鼠壁層腹膜TGF-β1觀察 ×400Fig 3 Expression of TGF-β1in parietal peritoneum from rats Magnification×400

表3 各組大鼠壁層腹膜TGF-β1分布的半定量分析Tab 3 Expression of TGF-β1in parietal peritoneum from rats

3 討 論

PD是治療終末期腎臟病的有效方法之一，因其具有不需特殊設(shè)備、操作簡(jiǎn)便、對(duì)血流動(dòng)力學(xué)影響小、殘余腎功能保護(hù)較好等優(yōu)點(diǎn)，得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。但隨著PD時(shí)間的延長(zhǎng)，腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生微絨毛喪失、細(xì)胞間隙增寬、細(xì)胞脫落等形態(tài)學(xué)改變，間皮細(xì)胞下大量細(xì)胞外基質(zhì)堆積［3］，腹膜發(fā)生纖維化最終可導(dǎo)致腹膜功能衰竭，這已成為患者退出PD的主要原因。在本研究中，對(duì)照組大鼠腹膜間皮細(xì)胞完好，間皮下基底膜薄并與結(jié)締組織相連，間皮下膠原纖維無(wú)明顯沉積;而PDS組大鼠腹膜明顯增厚(P＜0．01)，間皮細(xì)胞脫落，腹膜間皮下基質(zhì)明顯增多，有膠原纖維大量沉積(P＜0．01)。證明傳統(tǒng)葡萄糖PDS具有的生物不相容性可以導(dǎo)致腹膜纖維化的發(fā)生。

TGF-β是一個(gè)多功能的細(xì)胞因子，通過(guò)TGF-Smad或其它信號(hào)通路(如Ras/MEK/ERK和蛋白激酶C信號(hào)通路)參與許多生理和病理過(guò)程，促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)各種組織分化和參與纖維化［4－6］。其中，TGF-β1的過(guò)度表達(dá)在纖維化中起關(guān)鍵作用，并貫穿于纖維化的發(fā)生到維持的整個(gè)過(guò)程。在PD過(guò)程中，尿毒癥毒素如晚期糖基化終產(chǎn)物等通過(guò)人腹膜間皮細(xì)胞(Human peritoneal mesothelial cells，HPMC)表面受體刺激TGF-β1的分泌;傳統(tǒng)非生物相容性PDS中的高糖、低pH值及反復(fù)發(fā)生的腹腔內(nèi)細(xì)菌感染引起腹膜間皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞分泌TGF-。TGF-β1的過(guò)度表達(dá)和分泌促進(jìn)了細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，最終導(dǎo)致腹膜纖維化的發(fā)生［8－9］。Yuan 等［10］用重組人的TGF-β1反義核苷酸真核細(xì)胞表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HPMC，通過(guò)抑制TGF-β1的合成使HPMC表達(dá)纖維連接蛋白較空表達(dá)載體組下降17%。Margetts等［4］使用腺病毒載體將TGF-β1基因?qū)氪笫蟾骨唬? d后開始發(fā)現(xiàn)腹膜增厚、膠原過(guò)度沉積以及新生血管形成，并伴有腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)增加。

TGF-β1主要通過(guò)以下機(jī)制導(dǎo)致腹膜纖維化:(1)直接刺激腹膜間皮細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如膠原蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ，層粘連蛋白，纖維連接蛋白，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積［11］。(2)誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)間皮細(xì)胞的表面標(biāo)志E-cadherin和cytokeratins，上調(diào)表達(dá)α-SMA等纖維母細(xì)胞的表面標(biāo)志，使間皮細(xì)胞具有遷移功能和纖維母細(xì)胞的特性，能夠分泌膠原纖維、纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分，間接使細(xì)胞外基質(zhì)成分增多，即間皮細(xì)胞的間葉轉(zhuǎn)分化［12］，這將長(zhǎng)期保持間葉細(xì)胞狀態(tài)并加劇腹膜纖維化;(3)誘導(dǎo)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)的表達(dá)，CTGF可以促進(jìn)纖維母細(xì)胞的分化、遷移和黏附，并促進(jìn)其合成細(xì)胞外基質(zhì)，是纖維化形成過(guò)程的啟動(dòng)鑰匙［13］;(4)通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶和其抑制物的平衡，增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成并抑制其降解［14-15］。(5)刺激腹膜間皮細(xì)胞上調(diào)纖維蛋白溶酶原活化物(PA)抑制物PAI-1的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解［16］。(6)刺激細(xì)胞外基質(zhì)蛋白受體的合成。

丹參酮ⅡA是中藥丹參的提取物，也是丹參重要的有效藥理成分之一，具有明確的分子結(jié)構(gòu)，在臨床使用安全，無(wú)明顯副作用。研究已經(jīng)證明，丹參酮ⅡA可以減少血管損傷后細(xì)胞外基質(zhì)膠原的生成［1］，能通過(guò)抑制TGF-β1的表達(dá)減輕肺纖維化［2］。丹參能拮抗高滲PDS對(duì)腹膜間皮層結(jié)構(gòu)的損傷，維持腹膜間皮層結(jié)構(gòu)的完整性［17］。張丹等［18］通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丹參能提高腹膜物質(zhì)清除率，拮抗PDS引起間皮細(xì)胞過(guò)度表達(dá)AQP-1蛋白，提高ZO-1蛋白表達(dá)量，促進(jìn)間皮細(xì)胞增生，維持緊密連接結(jié)構(gòu)完整性，拮抗PDS對(duì)腹膜組織結(jié)構(gòu)和功能的損傷，延緩腹膜纖維化的發(fā)生。

本研究通過(guò)在PDS中添加不同濃度的丹參酮ⅡA，觀察其對(duì)腹腔注射PDS大鼠TGF-β1表達(dá)以及腹膜組織學(xué)改變的影響。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在PDS中添加丹參酮ⅡA后，腹膜間皮細(xì)胞脫落程度、腹膜致密層厚度、間皮下基質(zhì)的沉積均有明顯改善。同時(shí)，免疫組化顯示，腹膜組織TGF-β1表達(dá)較PDS組有明顯的下調(diào)(P＜0．01)，并且這種作用呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。提示丹參酮作為PDS添加劑可能具有抑制TGF-β1的表達(dá)，從而抑制腹膜間皮細(xì)胞損傷和腹膜致密層的增厚，潛在保護(hù)腹膜，延緩腹膜纖維化的作用。

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