郭旭東 刁其玉* 王月影 屠 焰 閆貴龍 汪新建鄧凱東 張乃鋒 鞠翠芳 李軍濤 宋 凱 顧小衛(wèi)

(1.中國農業(yè)科學院飼料研究所,農業(yè)部飼料生物技術重點實驗室,北京 100081;2.河南農業(yè)大學,農業(yè)部動物生長發(fā)育調控重點開放實驗,鄭州 450002;3.河北北方學院,張家口 075000;4.揚州大學,揚州 225009)

蘆丁促進大鼠泌乳性能的研究

郭旭東1刁其玉1*王月影2屠 焰1閆貴龍3汪新建2鄧凱東1張乃鋒1鞠翠芳1李軍濤2宋 凱2顧小衛(wèi)4

(1.中國農業(yè)科學院飼料研究所,農業(yè)部飼料生物技術重點實驗室,北京 100081;2.河南農業(yè)大學,農業(yè)部動物生長發(fā)育調控重點開放實驗,鄭州 450002;3.河北北方學院,張家口 075000;4.揚州大學,揚州 225009)

通過研究天然植物提取物蘆丁對大鼠泌乳性能、內分泌激素、臟器指數的影響,考察蘆丁調節(jié)大鼠泌乳的效果。試驗選擇18只Wistar受孕母鼠,隨機分為3組,每組6只,分別為對照組、蘆丁組(每日灌服蘆丁60mg/kg BW)、雌二醇組(每周肌肉注射雌二醇60μg/kg BW),從哺乳第4天開始連續(xù)給藥2周,基礎飼糧相同。測定指標包括:大鼠泌乳量,仔鼠平均體增重,乳腺器官指數,胸腺指數,脾臟指數,血漿與乳腺組織中雌激素(E2)、孕激素(P)、催乳素(PRL)、生長激素(GH)的含量。試驗結果顯示:蘆丁組大鼠泌乳量顯著高于對照組(P＜0.05),與雌二醇組差異不顯著(P＞0.05);仔鼠體增重蘆丁組與雌二醇組差異不顯著(P＞0.05),但顯著大于對照組(P＜0.05);大鼠血漿與乳腺組織中E2、PRL、GH的水平,蘆丁組顯著高于對照組(P＜0.05),低于雌二醇組(P＜0.05),P水平各組間差異不顯著(P＞0.05);大鼠乳腺、胸腺、脾臟器官指數雌二醇組顯著高于蘆丁組和對照組(P＜0.05)。由此得出,蘆丁能夠顯著提高大鼠泌乳量,促進大鼠胸腺、脾臟等器官的發(fā)育。

蘆丁;大鼠;泌乳;激素;器官指數

哺乳動物的母乳具有營養(yǎng)和免疫保護等功能,不僅能供給幼畜豐富的營養(yǎng),更重要的是,它還向幼畜提供抵御外來病原微生物侵襲的能力,同時充足的乳汁還是保證新生動物生長發(fā)育、種群繁衍和繁殖成功的關鍵因素[1-2]。動物泌乳功能的發(fā)揮依賴于泌乳器官乳腺,而乳腺的發(fā)育與泌乳功能受多種激素與生長因子的調控,其中非常重要的一個激素就是雌激素(E2)[3],即使分娩之后泌乳功能已經啟動,但乳腺的發(fā)育要延續(xù)到哺乳早期,因此在泌乳期內,動物的產奶量與母體的E2水平密切相關[4]。現有試驗證實E2促進乳腺發(fā)育和泌乳效果的影響都是顯著的[5]。蘆丁(rutin)又名蕓香苷,廣泛存在于自然界中,是一種從植物中提取的黃酮類化合物,具有多方面的生物活性,價廉易得[6],是具有廣闊開發(fā)前景的藥用植物活性成分[7],既可以作為治療藥物,又可以作為保健品[8]。蘆丁在結構上為由槲皮素C3位上的羥基和蕓香糖結合而形成的雙糖苷,如圖1所示[9-11],該結構與內源性雌激素17-β-雌二醇(17-β-E2)以及合成品己烯雌酚(DES)具有相似的平面雙苯環(huán)結構。通常認為,這種結構,可以通過結合于17-β-E2所占據的雌激素受體(ERs)的相同位點而發(fā)揮弱E2作用[12-14]。因此研究蘆丁對泌乳神經內分泌的影響,對乳腺發(fā)育和泌乳的作用,對類植物雌激素作用效果具有重要的意義。已有研究表明蘆丁具有維生素P樣作用[8]、抗自由基作用、抗脂質過氧化作用、舒張血管作用、抗病毒作用、拮抗血小板活化因子作用、抗急性胰腺炎作用、對胃潰瘍的保護作用等[7]。與蘆丁結構相似的大豆黃酮、葛根、黃芪、芒丙花素、淫羊藿等植物雌激素類物質能夠對動物機體的內分泌產生影響,促進動物泌乳[15-19]。但是,有關蘆丁的類E2作用研究還比較少見,其特殊的結構,是否能在機體內起到一定的E2作用亟需探討。本試驗以W istar泌乳大鼠為研究對象,通過研究灌服蘆丁對大鼠泌乳量、臟器指數、血漿與乳腺組織中E2、孕激素(P)、催乳素(PRL)、生長激素(GH)的水平和仔鼠體重等的影響,探討蘆丁的類E2作用和促進泌乳的效果,為蘆丁在泌乳生理上更廣泛的應用提供數據參考和依據。

圖1 蘆丁的結構Fig.1 Structure of rutin

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

本試驗于2009年12月—2010年2月,在農業(yè)部動物生長發(fā)育調控重點開放實驗室和河南農業(yè)大學生理生化實驗室進行。

1.2 試驗材料及動物

蘆丁:從槐花米中提取,購自山西云鵬制藥有限公司;雌二醇:苯甲酸雌二醇注射液,購自上海通用藥業(yè)有限公司。

普通級W istar大鼠,購自河南省實驗動物中心,其中雌鼠30只,體重200～250 g,雄鼠15只,體重250～300 g。在12 h光照和12 h黑暗的條件下進行喂養(yǎng),環(huán)境溫度為15～20℃,相對濕度50%～70%,自由采食和飲水。大鼠基礎飼糧的組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 試驗設計

W istar大鼠按照雌雄2︰1的比例進行配種,分娩后選擇分娩時間接近的18窩進行試驗,分為對照組、蘆丁組、雌二醇組,每組6窩,每窩留取6只仔鼠,用于泌乳試驗。以分娩當日為第0天,為減少分娩對大鼠造成的應激和體質下降的因素對試驗結果的影響[20],試驗從第4天開始灌服和記錄泌乳量,至第16天結束,灌服每天進行,泌乳量隔日記錄,共記錄7次。

對照組每日每頭灌服2 m L生理鹽水1次;蘆丁組每日灌服蘆丁1次(60 mg/kg BW);雌二醇組每周肌肉注射雌二醇1次(60μg/kg BW)。

1.4 樣品采集與處理

1.4.1 血漿樣品的采集與處理

在第7次記錄泌乳量后,按照10 m L/kg BW的劑量腹腔注射10%的水合氯醛麻醉,然后心臟取血5m L左右,于加有抗凝劑的真空采血管中,采血后離心(4 000 r/m in,15 m in)取血漿,分別裝于2支有蓋離心管中,于-20℃冰箱中保存,待測。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Com position and nutritient levels of basal diet(air-dry basis) %

1.4.2 乳腺組織、胸腺、脾臟樣品的采集與處理

大鼠取血后處死,迅速取腹部近尾端3對乳腺中右側的乳腺組織于液氮中速凍,然后置于-80℃冰箱中保存,待測;同時迅速取腹部近尾端3對乳腺中左側的乳腺組織、胸腺、脾臟,用吸水紙去除明顯附留的液體,迅速稱重;并取大鼠蹊部乳腺組織,用10%中性甲醛固定,用于組織切片制作。

1.4.3 乳腺組織勻漿液的制備

取大小適宜的已冷凍的大鼠乳腺組織,在冰生理鹽水中漂洗,去除血液,濾紙擦干,稱重,放入5～10 m L燒杯內,用移液管量取預冷的勻漿介質(生理鹽水),體積總量是組織塊重量的9倍,用組織搗碎機上下研磨制成10%的組織勻漿液,將制備好的10%的勻漿液4℃、2 000 r/m in離心15 min,取上清液于-20℃的冰箱中保存,待測。

1.5 測定指標及方法

1.5.1 大鼠泌乳量

參考袁淑德等[21]、Sheffields[22]、張榮慶等[15]、王艷玲等[23]、湯永玖等[24]、曹香林等[16]等方法,并略有改進。具體方法如下:將每只泌乳大鼠及其哺育的仔鼠作為一個觀察單位記錄,當天08:00起將仔鼠與泌乳大鼠分離,4 h后將仔鼠放回泌乳大鼠身邊,哺乳1 h,用天平分別稱取每窩大鼠哺乳前后的體重,其差值為該泌乳大鼠在此間的泌乳量。哺乳期間禁食禁水,從第4天至第16天共記錄7次。

1.5.2 仔鼠平均體增重

在測定大鼠泌乳量的同時,稱取每窩仔鼠哺乳前的體重,由每窩仔鼠的重量求得當日該窩仔鼠的平均體重,即為仔鼠體重[15-16,21-24]。將每次仔鼠體重(第1次記錄除外)減去第1次記錄的仔鼠體重,得到仔鼠體增重。

1.5.3 大鼠器官指數

大鼠器官指數(mg/g)=大鼠器官組織重(mg)∕體重(g)。

在本試驗中大鼠乳腺組織重指大鼠腹部近尾端3對乳腺中左側的乳腺組織重。

1.5.4 乳腺組織勻漿液中蛋白質含量的測定

用美國Thermo公司生產的微量分光光度計測定乳腺組織勻漿液中蛋白質的含量,用于計算組織蛋白中激素的含量。

1.5.5 激素含量

大鼠血漿與乳腺組織中 E2、P、PRL、GH 的測定采樣放射性免疫方法。試劑盒均為北京科美東雅生物技術有限公司生產,按試劑盒說明書要求操作。用γ-計數器測定沉淀每分鐘脈沖數(cpm),通過標準曲線換算血漿和乳腺組織勻漿液中激素的含量,根據乳腺組織勻漿液中蛋白質濃度及放射免疫所測乳腺組織勻漿液中的激素含量,將樣品中激素的量換算成單位組織蛋白中激素的含量。

1.6 主要儀器

SN-659型智能放免γ測量儀(上海應用物理所日環(huán)光電儀器有限公司);高速組織勻漿機(德國IKA);微量分光光度計(美國Thermo);高速冷凍離心機(美國Sigma);-80℃冰箱;-20℃冰箱;電子天平等。

1.7 數據統(tǒng)計分析

試驗數據采用SAS 8.2統(tǒng)計軟件ANOVA進程進行分析,差異顯著則采用Duncan氏法進行多重比較,數據用平均值±標準誤表示,顯著水平為P＜0.05。

2 結 果

2.1 泌乳大鼠平均泌乳量的變化

由表2可見,各組大鼠在初期泌乳量相差不大,隨著仔鼠日齡的增加,泌乳大鼠在1 h內的泌乳量都呈現上升趨勢。在泌乳的第4天和第6天,3組大鼠泌乳量差異不顯著(P＞0.05)。在第8天時,雌二醇組顯著高于對照組(P＜0.05),蘆丁組與對照組和雌二醇組差異不顯著(P＞0.05)。在第10～14天,雌二醇組顯著高于蘆丁組和對照組(P＜0.05)。在第16天,蘆丁組與雌二醇組差異不顯著(P＞0.05),雌二醇組和蘆丁組都顯著高于對照組(P＜0.05)。試驗全程大鼠泌乳量蘆丁組顯著高于對照組(P＜0.05),與雌二醇組差異不顯著(P＞0.05)。

表2 大鼠泌乳量Tab le 2 Milk yield of rats(n=6) g/h

2.2 仔鼠平均體增重

由表3可見,各組仔鼠平均體增重都隨日齡的增加而增長。在試驗第6、8天時,3組間差異不顯著(P＞0.05)。從第10天開始至第16天觀察結束,雌二醇組和蘆丁組均顯著高于對照組(P＜0.05)。

表3 仔鼠體增重Table 3 The body w eight gain of filial rats(n=36) g/只

2.3 大鼠器官指數

2.3.1 乳腺器官指數

乳腺器官指數數據見表4,數據顯示3組間差異顯著(P＜0.05),數值由小到大的順序為對照組、蘆丁組、雌二醇組。

表4 大鼠乳腺器官指數Table 4 Mammary gland index of rats(n=6)%

2.3.2 免疫器官指數

免疫器官指數數據見表5,對照組、蘆丁組、雌二醇組 3組間胸腺指數和脾臟指數均差異顯著(P＜0.05)。

表5 大鼠免疫器官指數Table 5 Immune organ indices of rats(n=6)%

2.4 血漿和乳腺組織中E2、P、PRL、GH的水平

試驗結果見表6。E2、PRL、GH在血漿與乳腺組織中的水平都呈現對照組、蘆丁組、雌二醇組數值依次增大的趨勢(P＜0.05)。P在血漿與乳腺組織中的水平組間差異均不顯著(P＞0.05)。

表6 大鼠血漿與乳腺組織中 E2、P、PRL、GH 的水平Table 6 The levels of E2,P,PRL and GH in p lasm a andm ammary gland tissues(n=6)

3 討 論

3.1 蘆丁對大鼠泌乳性能的影響

本試驗關于蘆丁對大鼠泌乳的影響結果顯示,從泌乳第4天至第16天,由組間差異不顯著(P＞0.05),到雌二醇組高于蘆丁組高于對照組(P＜0.05),至試驗后期雌二醇組和蘆丁組高于對照組(P＜0.05)。在整個試驗期內大鼠平均泌乳量蘆丁組(7.35 g/h)比對照組(5.73 g/h),提高了26.94%(P＜0.05),表明蘆丁能夠顯著提高大鼠的泌乳量。這與典型的植物雌激素異黃酮等的作用類似。張榮慶等[15]報道大豆黃酮顯著提高正常大鼠的泌乳功能;曹香林等[16]報道,富含植物雌激素的中草藥葛根、黃芪能夠顯著增加大鼠泌乳量;劉根桃等[17]報道,大豆黃酮能夠提高母豬泌乳量;郝振榮等[4]報道,大豆黃酮能夠提供奶牛產奶量。

哺乳仔鼠的體增重能夠間接反映母鼠泌乳量的變化[23]。研究發(fā)現,由于哺乳仔鼠攝入能量的唯一途徑是吸吮母鼠乳汁,因此,哺乳仔鼠的體增重與母鼠的乳汁量關系密切,是反映大鼠乳汁分泌量的客觀指標[25-26]。已有研究表明,大豆黃酮、葛根、黃芪等能夠顯著提高大鼠仔鼠平均體重[15-16]。本試驗中,泌乳初期各組仔鼠的體增重基本一致,隨著日齡的增加,體重都在快速增長,但雌二醇組和蘆丁組增長的速度明顯大于對照組,其仔鼠的體增重在中后期顯著地高于對照組(P＜0.05)。本試驗中蘆丁能夠顯著提高仔鼠的平均體增重,其效果接近雌二醇組,提示蘆丁具有較強的催乳作用,能夠顯著提高大鼠泌乳性能,這與何俏軍等[27]的研究結果一致。

乳腺器官指數,能夠從側面反映大鼠乳腺發(fā)育與泌乳功能情況。在本試驗中,各組大鼠乳腺器官指數的數值由小到大的順序為:對照組、蘆丁組、雌二醇組,提示蘆丁能夠促進乳腺的發(fā)育。上述結果與張榮慶等[15]報道的大豆黃酮能夠顯著提高泌乳大鼠乳腺重量,王偉群等[18]報道的芒丙花素能夠顯著增加小鼠乳腺相對重量相一致。

本試驗中大鼠泌乳量、仔鼠體增重變化、大鼠乳腺器官指數的試驗結果都表明,蘆丁具有類E2作用效果,能夠提高大鼠泌乳性能。

3.2 蘆丁對大鼠免疫器官的影響

動物的臟器重量與臟器指數是生物醫(yī)學研究的重要基礎指標[28-29],是臨床醫(yī)學和科學研究的重要依據,它不僅對動物生理狀態(tài)和飼養(yǎng)管理具有指導意義,而且是病理學、毒理學研究與探討發(fā)病機理等研究中動物選擇的依據[30]。測定臟器重量與其指數不僅能夠反映臟器本身的結構改變,同時還可以反映生理性功能狀態(tài),如免疫功能、生殖功能等[31-32]。脾臟與胸腺是動物體內重要的免疫器官,與體液免疫和細胞免疫均有密切關系,它們對細胞免疫、體液免疫以及巨噬細胞的吞噬功能等免疫功能發(fā)揮重要的作用[33]。免疫器官重量與指數在一定程度上可以反映免疫器官內淋巴細胞和巨噬細胞等免疫活性細胞的數量,可作為輔助性的免疫檢測手段,用來了解體內淋巴細胞總體水平[34]。本試驗研究結果顯示,大鼠胸腺指數蘆丁組顯著高于對照組(P＜0.05),脾臟指數蘆丁組顯著高于對照組(P＜0.05),表明蘆丁能夠顯著促進大鼠胸腺和脾臟器官的發(fā)育,這對于增強大鼠機體免疫機能有積極意義。

3.3 蘆丁對大鼠內分泌的影響

本試驗結果顯示,泌乳大鼠血漿中E2、PRL、GH的水平組間差異顯著(P＜0.05),數值由對照組、蘆丁組、雌二醇組依次增高。在乳腺組織中E2、PRL、GH的水平由低到高的順序也是對照組、蘆丁組、雌二醇組,組間差異顯著(P＜0.05),3種激素在大鼠血漿與乳腺組織中呈現相同的規(guī)律。血漿與乳腺組織中P含量組間差異不顯著(P＞0.05)。這與張榮慶等[15]報道的大豆黃酮能夠顯著地提高大鼠血液中GH、PRL的水平,王偉群等[25]報道的芒丙花素能夠顯著提高小鼠血漿 PRL水平,曹香林等[16]報道的葛根、黃芪能夠顯著提高大鼠外周血液中GH和PRL的水平,于燕等[19]報道的淫羊藿可明顯提高小鼠血清E2水平,姜晶晶等[35]報道的植物雌激素亞麻籽木脂素顯著提高大鼠血清中E2水平的結論相似。

本試驗關于蘆丁對大鼠泌乳內分泌激素影響的結果表明,蘆丁與內源性雌激素作用有相似或接近的效果,但其強度較為緩和,表現出微弱的E2活性。蘆丁化學名稱為5,7,3',4'-四羥基-3-蕓香糖黃酮,分子式為C27H30O16?3H2O,相對分子量為610.5[36-37],它及其代謝產物苷元槲皮素都具有與內源性雌激素相似的平面雙苯環(huán)結構,并符合植物雌激素的結構特點[14,38-39]。研究表明,蘆丁及其槲皮素在腸道經位于細胞頂膜的多抗藥性相關蛋白2(MRP2)的載體作用,通過腸上皮細胞進入動物機體內[40-41]。被吸收進入機體的蘆丁及其代謝產物槲皮素,由于結構的特點,能夠與ER結合,進而表現出類E2作用。已有研究證實,植物雌激素調節(jié)動物機體內分泌,進而影響泌乳功能的作用機制主要為:1)直接作用于乳腺的ER,表現雄激素樣生物效應[42];2)可作用于下丘腦、垂體、促進GH和PRL分泌,通過增加內源性的GH和PRL水平來促進乳腺發(fā)育和泌乳[16]。GH能夠調節(jié)物質代謝和營養(yǎng)成分在組織間的分配,以保持乳腺攝取豐富的營養(yǎng)[43];能夠刺激肝臟等其他器官產生胰島素樣生長因子(IGF-1),作用于乳腺細胞的IGF-1受體促進乳腺發(fā)育和泌乳[44],同時IGF-1作用于乳腺細胞后,能夠增加乳腺血流量,并刺激乳腺的上皮細胞分化成乳腺細胞,促使乳汁分泌增加[4]。PRL能夠作用于乳腺的PRL受體和誘導肝臟等器官產生PRL協(xié)同因子發(fā)揮作用[45];3)能夠影響動物神經內分泌系統(tǒng)的下丘腦-垂體-性腺軸,增加乳腺細胞、垂體、下丘腦的ERs的數目和親和力[46];4)能夠增加乳腺細胞孕激素受體(PR)的數目和親和力[42]。蘆丁作為植物E2類似物,其通過對大鼠內分泌激素的影響進而調節(jié)大鼠泌乳的作用機制與上述作用類似。

4 結 論

①本試驗每日灌服蘆丁60mg/kg BW能夠顯著提高大鼠泌乳量,提高仔鼠體增重,提高乳腺器官指數,提高血漿與乳腺組織中 E2、PRL、GH 的水平。

②本試驗每日灌服蘆丁60mg/kg BW能夠促進大鼠免疫器官胸腺、脾臟發(fā)育。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:d iaoqiyu@mail.caas.net.cn

(編輯 武海龍)

Rutin Prom otes Lactation of Rats

GUO Xudong1DIAO Qiyu1*WANG Yueying2TU Yang1YAN Guilong3WANG X ing jian2DENG Kaidong1ZHANG Naifeng1JU Cuifang1LIJuntao2SONG Kai2GU Xiaowei4

(1.Key Labora tory of Feed Biotechnology of Ministry of Agriculture,Feed Research Institu te,Chinese Academy of Agricultu ral
Scien ces,Beijing100081,Ch ina;2.Key Laboratory of AnimalGrow th and Development Ministry of Agriculture,
Henan Agricultural University,Zhengzhou450002,China;3.Hebei North University,Zhangjiakou075000,China;4.Yangzhou University,Yangzhou225009,China)

The objective of this study was to investigate the regulatory effect of rutin on lactation of rats by exam ining the effects of a natural p lantextract rutin onm ilk yield,endocrine horm ones and organ indices of rats.Eighteen p regnantW istar rats were random ly assigned to 3 treatments:contro l,gastric in fusion of rutin at 60mg/kg BW per day,and intramuscular in jection of estradiol 60μg/kg BW w eek ly from the fourth lactation day for tw o weeks with the same basal diet.The m ilk yield of rats,body w eightgain of filial rats,mammary gland index,thymus index,sp leen index,the levels of estrogen(E2),progesterone(P),prolactin(PRL)and growth horm one(GH)in plasma and gland tissuesweremeasured.Them ilk yield of the rats receiving rutin was higher than that of the control group(P＜0.05),but lower than that of the estradio l group(P＞0.05).The body w eight gain of the p rogeny from the rats receiving rutin w as higher than that of the contro l group(P＜0.05),but lower than that of the estradiol group(P＞0.05).The levels of E2,PRL and GH in p lasma and gland tissues of the rats receiving rutin w as higher than that of the controlgroup(P＜0.05),but less than that of the estradiol group(P＜0.05),and the dif ferences of P levelamong groups were not distinct(P＞0.05).The indexes ofmammary gland,thym us and spleen of the rats receiving estradio lwere higher than those receiving rutin or the control group(P＜0.05).In conclusion,dietary rutin significantly improves them ilk yield and accelerates growth of the thymus and spleen of rats.[Chinese Journalof Animal Nutrition,2010,22(6):1775-1782]

rutin;rats;lactation;hormone;organ indices

S816.15

A

1006-267X(2010)06-1775-08

10.3969/j.issn.1006-267x.2010.06.045

2010-06-08

國家“十一五”科技支撐計劃《農副產品飼料轉化與高效利用關鍵技術研究》(2006BAD 12B04-04)

郭旭東,男,貴州貴陽人,博士研究生,主要從事動物生理與營養(yǎng)研究。E-mail:gxd.168@163.com

*通訊作者:刁其玉,研究員,博士生導師,E-mail:diaoqiyu@m ail.caas.net.cn