蔡 勇 阿依木古麗 楊具田 馬忠仁 盧建雄 臧榮鑫 吳建平

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,蘭州 730070;2.西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,蘭州 730030;3.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,蘭州 730030)

綿羊前體脂肪細(xì)胞的原代培養(yǎng)及分化

蔡 勇1,2阿依木古麗3楊具田3馬忠仁3盧建雄3臧榮鑫3吳建平1*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,蘭州 730070;2.西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,蘭州 730030;3.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,蘭州 730030)

本試驗(yàn)旨在建立綿羊前體脂肪細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法,探討反芻動(dòng)物脂肪沉積機(jī)理。以1日齡羔羊的腎周脂肪組織為試驗(yàn)材料,采用組織塊法和酶消化法分離培養(yǎng)前體脂肪細(xì)胞,觀察形態(tài)學(xué)變化,測(cè)定生長(zhǎng)曲線,油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂肪含量,并用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)脂蛋白脂酶、過氧化物體增殖劑活化受體γ、脂肪酸合酶的表達(dá)量。結(jié)果表明:原代培養(yǎng)的細(xì)胞成分均一、增殖旺盛、分化率高,具有前體脂肪細(xì)胞的形態(tài)特征和基因表達(dá)特性,為綿羊前體脂肪細(xì)胞。本試驗(yàn)成功建立了綿羊前體脂肪細(xì)胞原代培養(yǎng)方法,并在體外重現(xiàn)了增殖和分化的過程。

綿羊;前體脂肪細(xì)胞;原代培養(yǎng);分化

脂肪組織不僅具有儲(chǔ)能功能,而且具有重要的內(nèi)分泌功能,其代謝失?？梢鸶视腿バ罘e過多,導(dǎo)致肥胖、胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化、Ⅱ型糖尿病等多種肥胖相關(guān)疾病的發(fā)生[1]。家畜過度沉積脂肪會(huì)降低其產(chǎn)品質(zhì)量,增加飼養(yǎng)成本。因此,認(rèn)識(shí)脂肪形成的規(guī)律和機(jī)制,調(diào)控體脂沉積并改善動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量在畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有重要意義。

前體脂肪細(xì)胞(preadipocyte)是脂肪細(xì)胞的前體細(xì)胞,是研究脂肪形成(adipogenesis)機(jī)理的理想模型,通過培養(yǎng)前體脂肪細(xì)胞,能夠在體外重現(xiàn)脂肪細(xì)胞的發(fā)生、增殖和分化的全過程,同時(shí)也便于觀察各種因素對(duì)整個(gè)過程的影響,探討脂肪形成機(jī)理,最終達(dá)到對(duì)脂肪形成的有效控制。國(guó)內(nèi)外已建立了來源于鼠前體脂肪細(xì)胞的細(xì)胞系,如 3T3L1、3T3F442A、ob17等[2],也開展了大鼠[3]、人[4]、豬[5]、雞[6]、草魚[7]和牛[8]前體脂肪細(xì)胞原代培養(yǎng)體系的研究,但尚未見綿羊前體脂肪細(xì)胞分離培養(yǎng)的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)在借鑒國(guó)內(nèi)外人及其他動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞體外原代培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上,以蘭州大尾羊?yàn)閯?dòng)物模型,建立綿羊前體脂肪細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)體系,為進(jìn)一步研究反芻動(dòng)物脂肪沉積機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

臨床檢查無異常的新生1日齡蘭州大尾羊,頸部放血致死,無菌條件下取腎及腎周脂肪組織,低溫運(yùn)輸,1 h送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 培養(yǎng)液及主要試劑的配制

DMEM/F12培養(yǎng)液:稱取 15.60 g DMEM/F12(G ibco),3.50 g NaHCO3,10m L胎牛血清(民海生物),蒸餾水定容至1 L。不加入胎牛血清即為無血清培養(yǎng)液。

紅細(xì)胞裂解液[3]:8.24 g NH4 C l,0.70 g KHCO3,29.22 mg EDAT,蒸餾水定容至1 L。

膠原酶消化液[3]:0.10 gⅠ型膠原酶(Sigm a)和2.00 g牛血清白蛋白溶于100m L無血清培養(yǎng)液中。

胰蛋白酶消化液:稱取0.25 g胰蛋白酶溶于100m L的無血清培養(yǎng)液中。上述溶液均調(diào)整pH至7.2～7.4,0.22μm微孔濾膜正壓過濾除菌,分裝后置-20℃保存。

1.3 前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng)方法篩選[9]

組織塊培養(yǎng)法:無菌條件下取新生羊腎周脂肪組織約3 g,用PBS緩沖液沖洗3次,剪去脂肪組織中可見的血管和其他結(jié)締組織,并將脂肪組織剪成1mm3左右的小塊,均勻地?cái)[放在25 m L培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),4 h后加入DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

膠原酶消化培養(yǎng)法:將脂肪組織處理成1mm3左右的小塊,轉(zhuǎn)移至含有玻璃珠的25m L三角燒瓶中,加入1 mg/m L的Ⅰ型膠原酶消化液,置于37℃水浴中消化50min(每5 m in振蕩1次),過孔徑為200目的鋼篩,1 000 r/m in離心5m in棄上清,加入紅細(xì)胞裂解液,吹打均勻,室溫靜置 10 m in,1 000 r/m in離心5m in,棄上清液,用培養(yǎng)液重懸,1 000 r/m in離心5 min,棄上清液,加入培養(yǎng)液并吹打均勻,即為綿羊前體脂肪細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù),按5×104個(gè)/m L的濃度接種于96孔和24孔培養(yǎng)板中,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2 d換液1次,并在顯微鏡下進(jìn)行觀察、照相。

1.4 細(xì)胞傳代培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

原代培養(yǎng)的前體脂肪細(xì)胞達(dá)到80%～90%匯合時(shí),用胰蛋白酶消化液消化0.5～3.0m in,用含血清培養(yǎng)液終止消化,按1︰3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)過程中,每2 d更換1次培養(yǎng)液,直至細(xì)胞匯合并鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿后,再重復(fù)上述操作。第4代培養(yǎng)至80%匯合時(shí),換用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液[DMEM/F12培養(yǎng)液中添加5μg/m L的牛胰島素(Sigma)、50μg/m L的轉(zhuǎn)鐵蛋白質(zhì)、5 ng/m L亞硒酸鈉和50 ng/m L的氫化可的松]進(jìn)行誘導(dǎo)分化。

1.5 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力[10]

將原代細(xì)胞懸液按每孔103～104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中(0 d),自第1天起,每隔2 d在同一時(shí)間取 8孔,在每孔中加 20μL噻唑藍(lán)溶液(M TT,5m g/m L、PBS配制),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng),棄去孔內(nèi)溶液后每孔加150μL二甲基亞砜(DMSO),避光震蕩10m in,在酶聯(lián)檢測(cè)儀上測(cè)定各孔OD490nm值,以時(shí)間為橫坐標(biāo),OD490nm值(表示細(xì)胞相對(duì)數(shù)量)為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.6 油紅O染色及脂肪含量的測(cè)定

脂肪細(xì)胞的油紅O染色按照盧建雄等[10]的方法進(jìn)行,細(xì)胞內(nèi)脂肪含量的測(cè)定參考Ram irez等[11]使用的方法,通過測(cè)定萃取液OD510nm值來衡量細(xì)胞內(nèi)的脂肪含量。

1.7 引物設(shè)計(jì)與合成、實(shí)時(shí)定量PCR

根據(jù)GenBank中登錄的綿羊脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL,X 68308)、過氧化物體增殖劑活化受體γ(peroxisome proliferators-activated receptorγ,PPARγ,AY 137204)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FAS,AB011671)和 β-肌動(dòng)蛋白(β-actin,NM_001009784)基因序列,用 Primer Prem ier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1),引物由上海生工生物工程有限公司合成。

用TRIzo l提取細(xì)胞總RNA,經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)后立即按照試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(realtime PCR,RT-PCR)(SLAN熒光定量PCR儀)。反應(yīng)體系為 25μL體系(SYBR Premax Tag 12.5μL、上下游引物各0.25μL、cDNA樣品2μL,水補(bǔ)足至 25μL)。反應(yīng)條件為:95.0℃預(yù)變性10 s、95.0 ℃變性5 s、54.0 ℃退火及延伸 25 s,40個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)的退火及延伸階段采集熒光信號(hào)數(shù)據(jù)。擴(kuò)增結(jié)束后立即進(jìn)行溶解曲線分析,從60.0℃開始每30 s升高1.0℃,直到94.0℃結(jié)束,共35個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)待溫度恒定后5 s采集熒光信號(hào)數(shù)據(jù),系統(tǒng)自動(dòng)分析數(shù)據(jù)后生成溶解曲線報(bào)告。反應(yīng)結(jié)束后系統(tǒng)根據(jù)梯度稀釋模板的擴(kuò)增情況自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以 β-actin做內(nèi)參用 ΔCt法[12]進(jìn)行分析細(xì)胞培養(yǎng)過程中脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá)情況。

表1 引物序列與RT-PCR反應(yīng)參數(shù)Tab le 1 Prim er sequences and RT-PCR reaction parameters

1.8 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均設(shè)置5次重復(fù),試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件中的One-w ay ANOVA進(jìn)行方差分析,Duncan氏方法進(jìn)行多重比較,顯著性水平定為P＜0.05。

2 結(jié) 果

2.1 綿羊前體脂肪細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

經(jīng)膠原酶消化后的綿羊前體脂肪細(xì)胞為圓形,3 h后細(xì)胞開始貼壁,2 d細(xì)胞呈梭形纖維狀、三角形或不規(guī)則形狀(圖1),4 d形成單層匯合,部分細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)微小脂滴(圖2),6 d分化的細(xì)胞增多,并可見散在分布的大小不等的脂滴(圖3),9 d脂滴逐漸融合,細(xì)胞核位于邊緣,之后細(xì)胞停止生長(zhǎng),脂滴逐漸變得灰暗,部分細(xì)胞脫落,浮于培養(yǎng)液內(nèi)(圖4)。

組織塊法培養(yǎng)綿羊前體脂肪細(xì)胞,4 d可觀察到組織塊邊緣游離出少量梭形或不規(guī)則形成纖維樣細(xì)胞(圖5),6 d左右大量增殖,圍繞脂肪塊呈漩渦狀排列,并逐漸形成局部單層匯合,積聚脂肪顆粒(圖6)。組織塊法培養(yǎng)的前體脂肪細(xì)胞分布不均,9 d時(shí)部分區(qū)域細(xì)胞形成匯合,細(xì)胞內(nèi)充滿脂滴,而有的區(qū)域細(xì)胞呈梭形或三角形,處于分裂增殖狀態(tài),由于細(xì)胞從組織塊中游離出的時(shí)間不同,細(xì)胞增殖和分化不同步(圖 7)。經(jīng)油紅O染色的脂肪細(xì)胞在顯微鏡下觀察,脂滴被親脂的油紅O著色而呈橘紅色,表明具有脂肪細(xì)胞的特征(圖8)。

圖8 組織塊法培養(yǎng)9 d經(jīng)油紅O染色的脂肪前體細(xì)胞(200×)Fig.8 Morphology of preadipocyte cultured by explantingmethod and stained with oil red O(200×)

2.2 前體脂肪細(xì)胞的傳代培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

細(xì)胞傳代后2 h內(nèi)貼壁,傳代細(xì)胞與原代細(xì)胞形態(tài)一致(圖9),增殖速度較原代細(xì)胞明顯增快,2～3 d即可達(dá)到單層匯合。再次傳代后細(xì)胞自主分化為脂肪細(xì)胞的能力逐漸減弱,4代后,幾乎沒有細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞,但改用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液培養(yǎng)后,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂滴(圖10),表明細(xì)胞分化能力有所恢復(fù)。

圖9 第4代的前體脂肪細(xì)胞形態(tài)(200×)Fig.9 Morphology of the 4th generation of preadipocy tes(200×)

2.3 M TT比色法繪制生長(zhǎng)曲線

由圖11可見,曲線呈“S”型,3～9 d為指數(shù)生長(zhǎng)期,之后便進(jìn)入平臺(tái)期。綿羊前體脂肪細(xì)胞的倍增時(shí)間為54.6 h。

2.4 細(xì)胞內(nèi)脂肪含量的變化

由圖12可見,隨培養(yǎng)時(shí)間增加,細(xì)胞內(nèi)脂肪含量逐漸增加,在原代培養(yǎng)的前3天,幾乎見不到脂滴,OD510 nm值接近于 0;培養(yǎng)4 d后,極小部分細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)微小脂滴,OD510 nm值開始上升,細(xì)胞內(nèi)脂滴逐漸沉積,5～11 d期間OD510 nm值呈線性上升,11 d后脂滴沉積速度開始變慢,與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果一致。

2.5 前體脂肪細(xì)胞分化過程中標(biāo)志基因表達(dá)情況

圖12 前體脂肪細(xì)胞分化過程中細(xì)胞內(nèi)脂肪含量的變化Fig.12 Changes of fat contents in cells during the preadipocy tes dif ferentiation

如圖13所示,LPL和PPARγ在前體脂肪細(xì)胞分化的早期(培養(yǎng)3 d)就有表達(dá),但顯著低于分化中期(7 d)和分化后期(11 d)(P＜0.05)。FAS在3 d時(shí)表達(dá)量極少,到7 d顯著增加(P＜0.05)并達(dá)到最大值,11 d時(shí)又顯著降低(P＜0.05)。

圖13 綿羊前體脂肪細(xì)胞分化過程中LPL、PPARγ和FAS基因的表達(dá)情況Fig.13 LPL,PPARγand FAS gene expression during the ovine preadipocyte differentiation

3 討 論

3.1 綿羊前體脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的構(gòu)建

細(xì)胞體外分離培養(yǎng)是研究復(fù)雜的生物系統(tǒng)的重要手段,通過分離培養(yǎng)綿羊前體脂肪細(xì)胞,在體外重現(xiàn)增殖分化過程,是研究反芻動(dòng)物脂肪形成機(jī)理的重要途徑。本試驗(yàn)通過酶消化法和組織塊培養(yǎng)法獲得了綿羊前體脂肪細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)組織塊培養(yǎng)法具有操作簡(jiǎn)便、不易污染、成本較低、成功率高等優(yōu)點(diǎn),但細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng),獲取細(xì)胞的數(shù)量有限,并且細(xì)胞增殖和分化時(shí)間不一致,細(xì)胞均一性差,不便于試驗(yàn)處理;酶消化法能一次性獲取大量的前體脂肪細(xì)胞,并且細(xì)胞均勻一致,便于試驗(yàn)處理。在原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)中,應(yīng)用脂肪細(xì)胞貼壁時(shí)間長(zhǎng)、胰蛋白酶消化時(shí)間短的特點(diǎn),進(jìn)行差速貼壁和差速消化的方法可對(duì)其進(jìn)一步純化[13],便能得到大量純度高、均勻一致的前體脂肪細(xì)胞。在試驗(yàn)中我們選用消化法進(jìn)行培養(yǎng)。

細(xì)胞體外培養(yǎng)的主要影響因素是培養(yǎng)液和培養(yǎng)環(huán)境。培養(yǎng)液的選擇上,國(guó)內(nèi)外各個(gè)實(shí)驗(yàn)室不盡相同,DMEM[5-6]、DMEM/F12[4,7]、M 199 在不同物種的前體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)中均有應(yīng)用,我們對(duì)不同的培養(yǎng)液做了預(yù)篩選后,因DMEM/F12對(duì)綿羊前體脂肪細(xì)胞的增殖、分化和脂滴沉積均優(yōu)于其他培養(yǎng)基,而被采用,這與牛[8]、大鼠[3]、人[4]和草魚[7]的研究結(jié)果一致,而與豬[5]和雞[6]的不同,這可能是物種之間的差異所致。培養(yǎng)環(huán)境與豬[5]、雞[6]、牛[8]、大鼠[3]和人[4]的前體脂肪細(xì)胞一致,37℃、5%CO2及飽和濕度均為最佳條件。

3.2 前體脂肪細(xì)胞的增殖和分化

脂肪沉積包括脂肪細(xì)胞數(shù)目增加和體積增大。前體脂肪細(xì)胞增殖、分化為成熟脂肪細(xì)胞、甘油三酯的合成以及脂肪細(xì)胞的凋亡,是一系列基因和細(xì)胞因子調(diào)控的結(jié)果[14-15]。對(duì)脂肪細(xì)胞增殖和分化相關(guān)基因的研究都是在體外進(jìn)行的,因此細(xì)胞分化的模式也受材料來源、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等的影響。Ailhaud等[16]認(rèn)為L(zhǎng)PL和PPARγ的表達(dá)是脂肪細(xì)胞分化的早期標(biāo)記,LPL的表達(dá)預(yù)示著脂肪沉積的開始,并且LPL的表達(dá)是在細(xì)胞匯合時(shí)自然發(fā)生的,不依賴于脂肪細(xì)胞分化所必需的各種介質(zhì)。在前體脂肪細(xì)胞分化的早期,LPL和PPARγ就有表達(dá),但是顯著低于分化中期和分化后期,PPARγ在細(xì)胞分化后期才達(dá)到表達(dá)的高峰。PPARγ的主要異構(gòu)體是脂肪細(xì)胞和脂肪組織所特有的,他們?cè)谇绑w脂肪細(xì)胞中就能檢測(cè)到,在加入誘導(dǎo)分化的激素或介質(zhì)之后表達(dá)迅速增加,在成熟的脂肪細(xì)胞中達(dá)到最高水平[17]。脂肪酸合成酶(FAS)是脂肪酸生物合成的關(guān)鍵酶,在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)受激素和營(yíng)養(yǎng)等方面的因素調(diào)控[18],是脂肪細(xì)胞晚期分化的分子標(biāo)志[19],他在前體脂肪細(xì)胞中不轉(zhuǎn)錄表達(dá),而在分化的脂肪細(xì)胞中有較高表達(dá)[20],試驗(yàn)中,培養(yǎng)7 d后細(xì)胞的FAS的基因表達(dá)量顯著高于3 d的(P＜0.05),這與脂肪沉積的速度相一致。

本試驗(yàn)培養(yǎng)的原代前體脂肪細(xì)胞分離自1日齡羔羊的脂肪組織,培養(yǎng)2 d后就能觀察到大量梭形、三角形或不規(guī)則形狀的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞——綿羊前體脂肪細(xì)胞。前體脂肪細(xì)胞在培養(yǎng)過程中不需要誘導(dǎo)即可自動(dòng)分化為脂肪細(xì)胞。但在傳代過程中,這種自動(dòng)分化能力逐漸減弱,到第4代時(shí)幾乎觀察不到充脂的脂肪細(xì)胞,但是加入誘導(dǎo)劑后,又可見部分細(xì)胞充脂。并且原代前體脂肪細(xì)胞自動(dòng)分化過程中呈現(xiàn)出聚集現(xiàn)象,即分化為成熟脂肪細(xì)胞的大多幾個(gè)到幾十個(gè)聚集在一起,很少見到單個(gè)分散存在的細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞,這有可能是分離前體脂肪細(xì)胞時(shí)部分細(xì)胞處于分化期,在體外培養(yǎng)條件下繼續(xù)分化并分泌有關(guān)的激素,通過旁分泌途徑誘導(dǎo)相鄰細(xì)胞的分化,但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,本試驗(yàn)建立了綿羊前體脂肪細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法,探索了綿羊前體脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及分化的生物學(xué)特征,在體外重現(xiàn)了其增殖的過程,檢測(cè)了相關(guān)基因的表達(dá)情況,為進(jìn)一步研究反芻動(dòng)物脂肪代謝機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

①酶消化法和組織塊培養(yǎng)法均能培養(yǎng)出綿羊前體脂肪細(xì)胞,但酶消化法獲得的細(xì)胞數(shù)目多且均勻一致,更便于試驗(yàn)處理。

②綿羊原代前體脂肪細(xì)胞在體外含血清的DM EM/F12培養(yǎng)液中能自行分化為脂肪細(xì)胞,在分化中后期 LPL、PPARγ和FAS的基因表達(dá)增強(qiáng)。

③本試驗(yàn)初步建立了綿羊前體脂肪細(xì)胞原代培養(yǎng)方法,并在體外重現(xiàn)了增殖和分化的過程。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:w ujp@gsau.edu.cn

(編輯 王智航)

Primary Culture and Differentiation ofOvine Preadipocytes

CAIYong1,2Ayimuguli3YANG Jutian3MA Zhongren3LU Jianxiong3ZANG Rongxin3WU Jianping1*

(1.College of Animal Science and Technology,Gansu Agricu ltural University,Lanzhou730030,China;2.Science Experimen tal Center,Nor thwest University for Nationalities,Lanzhou730030,China;3.College of Life Science and Engineering,Northwest Un iversity for Nationalities,Lanzhou730030,Ch ina)

The study w as conduc ted to set up amethod for prim ary culture of ovine p readipocytes,and p robe them echanism of fat deposition in rum inants.Preadipocyteswere isolated from perinephrit fat of 1-day-o ld ovine and cultured by digestive and exp lantingmethods.Themorphological changes of cultured cellswere observed,growth curvew as determ ined,intracellular fat contents weremeasured by themethod of oil red O staining,and LPL,PPARγand FAS expression levels were analyzed by real-tim e PCR.Results showed as follows:primary cultured cells show ed homogeneous cell components,vigorous proliferation and high differentiation ratio and p resented themorpho logy charac teristics and idiotype genes of p readipocytes.All the resu lts verified their preadipocy te identity.In this paper,amethod for p rimary cu lture of p readipocytesw as successfully set,and the processes of proliferation and dif ferentiation were exhibitedin vitro.[Chinese Journal of Animal Nutrition,2010,22(6):1768-1774]

ovine;preadipocyte;primary culture;differentiation

S826

A

1006-267X(2010)06-1768-07

10.3969/j.issn.1006-267x.2010.06.044

2010-06-29

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30871811);國(guó)家民委科研項(xiàng)目(2009-158-09X B02)

蔡 勇(1979—),男,土家族,湖北宜昌人,講師,博士研究生,主要從事生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究。E-mail:caiyong1979@163.com

*通訊作者:吳建平,教授,博士生導(dǎo)師,E-mail:w ujp@gsau.edu.cn